响应曲面法优化防己中汉防己甲素及汉防己乙素的提取工艺

胡筱希 朱荣 唐 新 黄大权 卢文杰 陆国寿

1.广西中医药研究院，广西 南宁 530022；2.广西大海阳光药业有限公司，广西 南宁 530022

防己为防己科植物粉防己(Stephaniatetrandra S.Moore)的干燥根,具有祛风止痛、利水消肿、用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒等[1]。防己中的汉防己甲素(又名粉防己碱)和汉防己乙素(又名防己诺林碱)为其主要的活性成分，两者均为天然的双苄基异喹啉类生物碱，汉防己甲素具有抗肿瘤、抗炎、抗心律失常、抗菌、降压等作用[2]，以其为主要成分的中成药“汉防己甲素”和“汉防己甲素注射液”广泛用于临床上对各期矽肺病的治疗[3-4]。汉防己乙素具有抗肝缺血再灌注损伤、诱导人肺癌95D细胞凋亡等作用[5-6]。本实验拟采用单因素试验结合响应曲面法优化防己中的汉防己甲素及汉防己乙素的提取工艺，为防己中的活性成分研究及深度开发利用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 数显恒温水浴锅HH-S2(金坛市医疗仪器厂)，JJ224BC电子天平(常熟双杰)，Waters2695 高效液相色谱仪(日本 Waters 公司)，KS-3200DE超声波清洗器(昆山洁力美)，LDZ4-0.8A离心机(北京医用离心机厂)。

1.2 药材与试剂 防己药材由广西大海阳光药业有限公司提供；汉防己甲素HPLC≥98%(YM0311YBB，上海源叶生物)；汉防己乙素HPLC≥98%(RO1A6F2，上海源叶生物)；乙腈、甲醇、二乙胺为色谱纯；乙醇为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 汉防己甲素和汉防己乙素测定方法

2.1.1 HPLC色谱条件 色谱柱C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.1%二乙胺(30∶35∶35)；检测波长：282 nm；柱温：25℃；理论塔板数：按汉防己甲素峰计算不低于5000；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。如图1所示。

2.1.2 溶液配制 ①对照贮备液：分别精密称取12.5 mg汉防己甲素、汉防己乙素，用甲醇溶解，定容至25 mL量瓶中，摇匀，即得500 μg/mL的混合对照品溶液。②供试品溶液：精密称取1.0 g防几药材，加适量超声提取得溶液到供试品。按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，如图1所示。

2.1.3 标准曲线绘制 分别精密吸取对照品溶液贮备液0.8、1.2、1.6、2、2.4、3. 2 mL，稀释到10 mL，摇匀，得到40、60、80、100、120、160 μg/mL混合对照品溶液。以甲醇作为空白溶液，注入色谱仪，以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得汉防己甲素回归方程Y=9038.4X-100992，相关系数r2=0.9997；汉防己乙素回归方程Y=7137X-38969，相关系数r2=0.9998。

2.2 单因素提取试验

2.2.1 乙醇体积分数 称取防几药材粉末1.0 g，在料液比1∶40 g/mL，超声时间40 min，分别以60%、70%、80%、95%、100%乙醇提取，结果如图2所示。汉防己甲素、汉防己乙素均在70%提取率最高。

2.2.2 料液比 称取防己药材粉末1.0 g，在乙醇浓度95%，超声时间40 min的条件下，分别以料液比(g∶mL)1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60进行提取，结果如图3所示。汉防己甲素在料液比1∶40时，提取率最高，汉防己乙素在1∶50时提取率最高。

2.2.3 超声时间的影响 称取防己药材粉末1.0 g，在乙醇浓度95%，在料液比1∶40 g/mL，分别提取20、30、40、50、60 min，结果如图4所示。在20～50 min汉防己甲素及汉防己乙素的提取率均呈上升趋势，超过50 min提取率下降，因此超声时间在50 min较合适。

2.3 响应曲面实验设计 根据单因素试验结果和响应面中心组合试验设计原理，选取3个因素为响应因素，浸膏中汉防己甲素、汉防己乙素提取率为响应值，运用Design-Expert 10软件设计三因素三水平响应面试验，结果见表1。

2.4 响应面优化试验结果 试验方案及结果见表2。

表1 Box-Behnken试验因素与水平

表2 响应面优化实验分析方案及结果

拟合试验数据，建立二次多元回归方程：R(汉防己甲素)=13.08-0.42B+0.15B+0.24C+0.20AB-7.500E-0.03AC-0.060BC-0.066A2-0.12B2-0.19C2；R(汉防己乙素)=8.33-0.51A-0.27B+0.073C+0.19AB-0.22AC-0.15BC-0.52 A2-0.33 B2-0.044C2，对其进行方差分析，结果见表3、表4。

表3 方差分析表(汉防己甲素)

表4 方差分析表(汉防己乙素)

2.5 验证试验 在最佳提取汉防己甲素工艺乙醇体积分数为60%，料液比为1∶36.07，超声时间为57.12 min，进行3次试验，提取率分别为13.48 mg/g、13.51 mg/g、13.54 mg/g，平均值为13.51 mg/g。在最佳提取汉防己乙素工艺乙醇体积分数为62.49%，料液比为1∶37.71，超声时间为59.38 min，提取率分别为为8.75 mg/g、8.74 mg/g、8.67 mg/g，平均值为8.72 mg/g。结果分析见表5，试验值与理论值无显著性差异。

表5 验证试验结果分析

3 讨论

在选择提取溶剂时考察了乙醇、甲醇两种溶剂，发现防己中汉防己甲素和汉防己乙素在甲醇中提取率低，这是由于两种生物碱为双苄基异喹啉类生物碱，碱性较强，容易结合氢离子成盐，在甲醇中溶解率低[7]。

用乙醇进行超声提取防己药材仅得到汉防己甲素和汉防己乙素的粗提物，需进一步纯化才能得到高纯度的汉防己甲素和汉防己乙素。杨欣欣等采用AB-8大孔树脂法进行分离纯化，但汉防己甲素和汉防己乙素的纯度仅为50%[8]。魏晋宝等采用回流提取、萃取、氧化铝色谱柱层析、重结晶法得到了高纯度的汉防己甲素[9]。

本实验采用响应曲面法考察乙醇体积分数、料液比及超声时间对提取效果的影响。Design expert 10预测得到汉防己甲素最佳提取工艺为乙醇浓度为60%，料液比为1∶36.07，超声时间为57.12 min，提取率为13.53 mg/g；最佳提取汉防己乙素的提取工艺为乙醇浓度62.49%，料液比为1∶37.71，超声时间为59.38 min，提取率为8.71 mg/g，验证值与预测值相近，本实验的提取工艺及含量测定研究均为其今后的质量控制提供依据。