从水通道蛋白4探讨附子理中汤温阳健脾祛湿的作用❋

王露瑶，宁晚玲,2，唐汉庆△，王有科，李克明

(1. 右江民族医学院,广西 百色 533000； 2. 广西中医药大学, 南宁 530001)

结直肠癌是常见的肿瘤，有胃肠道腹泻及中性粒细胞减少症等骨髓抑制表现，是结直肠癌化疗常见的毒副作用[1-2]。中药在癌症治疗中起到减轻化疗或放疗副作用，在提高癌症患者生存质量等方面具有一定的优势[3]。附子理中汤有温脾肾阳、健脾祛湿止泻作用。中医理论认为“肾脾为先后天之本”，且“脾为气血生化之源”，所以该方是针对胃肠道腹泻及中性粒细胞减少症化疗副作用的适用方剂。

附子理中汤由理中汤加附子组成，针对脾肾阳虚症见吐、利、痛、胀、手足逆冷等症状，是温阳健脾的常用方剂。附子理中汤温阳健脾功效表现广泛，研究表明其对于能量及物质代谢[4]、机体产热过程[5]、胃肠动力学[6]均有良性调控作用。对于脾阳虚衰引起的腹泻、水肿等病变，采用温脾肾阳、健脾利水治法已得到实践证明，但其温阳健脾祛湿的分子生物学机制仍然需要更多的实验研究。本实验工作通过建立大鼠脾阳虚模型，采用附子理中汤作为干预药物，观察其对阳虚腹泻的改善作用，从水通道蛋白4功能作用探讨附子理中汤对于胃肠道腹泻的起效机理。

1 材料

1.1 动物

清洁级Wistar大鼠120只，雌雄不拘，体质量(174± 10)g，由右江民族医学院科学实验中心提供，合格证号SCXK(桂)2017-0003，常规饲养，适应环境1周后开始实验。

1.2 试剂与药物

Real-time PCR试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；ANP、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、SCr、BUN、UCr试剂盒(Abcam公司)；炮附子、党参、白术饮片(北京同仁堂科技发展股份有限公司)；干姜(康美药业股份有限公司)；炙甘草(贵州同济堂制药有限公司)。

1.3 仪器

Real-time PCR仪(美国伯乐公司)；酶标仪(Thermo Labsystem 公司)；紫外分光光度仪(Beckman公司)；超低温冰箱(日本三洋公司)；电子天平(瑞士Mettler公司)；电动玻璃匀浆机(宁波新芝公司)；高速低温离心机(ALC公司)。

2 方法

2.1 动物分组及造模

清洁级Wistar大鼠120只，随机分为空白对照组(对照组)、假手术组、模型组和附子理中汤高、中、低剂量组共6组各20只。模型组高、中、低剂量组采用“肩胛骨间棕色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT)切除术+高脂饲料喂养+隔日寒冷环境刺激”方法造模，假手术组只找到BAT但不切除，术后均第 1 天开始喂高脂饲料共30 d。高、中、低剂量各组分别按照每天40、20、10 g/kg以附子理中汤灌胃，附子理中汤给药剂量根据参考文献[7]按照临床人用剂量通过体表面积法换算为大鼠剂量。其余各组给予等体积的生理盐水灌胃，均连续干预30 d，模型组于造模成功后第1天取材，其余各组与给药组在第30天末次干预或灌药后取材。造模制备评判标准参考文献[8-9]中的脾阳虚“阳虚症状群”和“消化不良症状群”。“阳虚症状群”包括形寒、肢冷、倦怠、消瘦等，“消化不良症状群”包括腹泻、纳呆、腹痛等。通过行为学观察，注意到模型动物喜扎堆、蜷伏懒动、毛色枯槁、稀便、肛周污秽、喂饲量减少等，与上述文献描述的症状相似。

2.2 附子理中汤制备

按照2015版《中国药典》附子理中汤，由炮附子、党参、白术、干姜、炙甘草按照3∶5∶4∶3∶2比例组方。经右江民族医学院药理教研室鉴定，附子为毛茛科植物乌头的子根，党参为桔梗科植物党参的干燥根，白术为菊科植物白术的干燥根，干姜为姜科植物姜的干燥根茎，甘草为乌拉尔甘草的根。按比例称取药材，各药蒸馏水浸泡12 h，炮附子先煎1 h后纳入其余诸药煎煮40 min，纱布滤除药液，余渣加适量水继续煎煮40 min，纱布滤除药液，合并2次滤液，水浴加热浓缩制备成浓度为含生药量2 g/mL的药液，4 ℃冰箱保存待用。

2.3 回肠组织观察

取回肠组织4% 多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，切片厚度5 μm， 60 ℃烤箱中烘烤30 min，二甲苯、无水酒精以及95%酒精、 80%酒精、70%酒精及三蒸水脱蜡及水，苏木精-伊红 (HE) 染色，甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察回肠组织变化。

2.4 AQP4 mRNA表达

表1示，Real-time PCR检测。取结肠组织50 mg加入冷冻Trizol 2 mL，研磨器中仔细研碎并匀浆放入EP管，20 ℃孵育5 min，加入氯仿0.4 mL，旋紧盖子用力摇动15 s，20 ℃孵育3 min，4 ℃离心15 min(12000 r/min)，取上清液至新的EP管，加0.5 mL异丙醇，20 ℃孵育样品10 min，4℃离心10 min(12000 r/min)，弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀1次，4 ℃离心5 min(7500 r/min)，弃乙醇真空干燥5 min，加DEPC处理水溶解RNA，-80 ℃保存备用。取适量RNA溶液按照逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA。对逆转录产物进行PCR扩增反应，并以GAPDH为内参。PCR反应条件为94 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s 40次循环变性，61 ℃ 30 s延伸，55 ℃ 30 s 81次循环退火，72 ℃ 10 min稳定产物，4 ℃ 60 min保存。AQP4基因引物由生物公司代为设计合成。

表1 RT-PCR引物序列

取适量PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳，经凝胶成像系统读取目的基因灰度值，以目的基因灰度值/ GAPDH基因灰度值的比值为目的基因mRNA的相对表达量。

2.5 ANP含量、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平及SCr、BUN、 UCr含量检测

腹主动脉取血5 mL，血液静置0.5 h，4℃离心10 min(2500 r/min)，留取血清-70 ℃ 冻存待检。采用ELISA法检测ANP含量、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平，常规生化法检测SCr、BUN、 UCr含量，严格按照操作说明进行。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 回肠组织形态学

图1示，对照组与假手术组回肠组织结构完整，层次分明，界限清晰，未见水肿，回肠黏膜皱襞完整；模型组可见回肠组织结构完整，但界限边缘不整甚至模糊，多处可见水肿，染色浅淡，局部可见回肠绒毛变矮或消失，炎细胞浸润；低剂量组和中剂量组具体情况大致同模型组未见明显改善；高剂量组较模型组明显改善，与对照组和假手术组基本接近，组织结构完整，界限明显清晰，局部固有层轻度水肿，间质较为疏松，回肠黏膜皱襞较完整，未见异常病变，黏膜上皮细胞与腺体分布正常，炎细胞浸润减轻。

注：A.对照组；B.模型组；C.假手术组；D.剂量组；E.剂量组；F.低剂量组图1 各组回肠组织形态学变化比较(HE，×200)

3.2 各组炎症因子IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较

表2示，与对照组比较，模型组IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，中、高剂量组IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均下降(P<0.05，P<0.01)。

表2 各组炎症细胞因子水平比较

3.3 各组ANP含量、AQP4 mRNA表达、SCr、BUN和UCr含量比较

表3示，与对照组比较，模型组ANP含量、AQP4 mRNA表达均降低(P<0.05，P<0.01)，SCr、BUN、UCr含量均升高(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，中、高剂量组ANP含量、AQP4 mRNA表达均升高(P<0.05，P<0.01)，各剂量组SCr、BUN、UCr含量均有不同程度的减低(P<0.05，P<0.01)。

表3 各组ANP含量、AQP4 mRNA表达、SCr、BUN和UCr含量比较

4 讨论

腹泻属于中医学 “泄泻”“飨泻”范畴。《素问·阴阳应象大论篇》指出：“清气在下，则生飨泄; 浊气在上，则生月真胀”。《难经》也认为： “湿多成五泄”，腹泻的形成与水湿、痰浊内停密切相关。“脾主运化”是“脾”的生理功能之一。一方面，脾通过运化水谷精微发挥营养、滋润全身的作用；另一方面，又通过运化水湿、痰浊之邪保持机体水液代谢平衡，避免水湿、痰浊之邪内停。因此，《素问·至真要大论篇》指出：“诸湿肿满，皆属于脾”，认为水湿内停、泄泻水肿等均属于脾“运化”功能失常的表现。“脾主运化”生理功能的发挥，有赖于“脾阳升清”作用。如果脾阳虚衰、清阳不升则脾运化功能减弱，水湿停聚，下迫为泄泻。正如《素问·阴阳应象大论篇》所言：“故清阳为天，浊阴为地……故清阳出上窍，浊阴出下窍”，表明脾阳虚衰是腹泻发生的重要病机。针对腹泻发生的脾阳虚衰病机，《素问·至真要大论篇》提出：“高者抑之,下者举之”的治疗大法。李东垣也指出：“脾宜升则健”，主张采用温运脾阳法达到升脾阳止泻的目的。肾阳为人身元阳，慢性腹泻久泻易致肾阳不足，肾阳虚则不能温煦脾阳。本实验工作采用附子理中汤作为脾阳虚证干预药物，是为振奋、鼓舞肾阳进而温煦脾阳以加强温阳之力。

AQP4是水通道蛋白家族之一，是维持水液平衡的重要分子。研究表明，上调大鼠胃肠道AQP4 含量和 AQP4 mRNA表达， 能促进胃肠道黏膜对水的重吸收[10]。课题以往研究表明，ANP促进结肠对水、氯化钾的吸收，从而改善脾阳虚大鼠腹泻症状，AQP4可通过AQP4-ANP-pGC-cGMP信号传导途径调节水液代谢[11]。而最近研究表明，AQP4尚可减轻炎症反应，缓解腹痛腹泻症状[12-13]。因此，AQP4既可促进胃肠道黏膜对水的重吸收(表现为祛湿作用)，也可减轻炎症反应(表现为健脾作用)，对于脾阳虚腹泻是一个重要的治疗靶点。本实验中注意到，附子理中汤能上调AQP4 mRNA表达和ANP含量。胃肠组织形态学也观察到，各剂量组水肿与炎症细胞浸润状况也有不同程度改善，改善程度与剂量有关，以高剂量明显，提示临床需要重视剂量的使用问题。

关于本实验工作取材的时间节点，模型组于造模成功后第1天取材，其余各组与给药组在第30 天末次干预或灌药后取材。这是考虑到脾阳虚证包含的许多现代疾病属于慢性疾病范畴，慢性病一般都存在机体自身的自我愈合、自我适应的演变进程，为得到实时的脾阳虚证指标检测结果，故选取造模成功后取材检测。由于脾阳虚证所属的许多慢性病临床治疗常看到需要守方治疗，花费的时间可能较长，因此给药组选取第30 天末次灌药后取材，对于此种考虑尚请学界同仁批评指正。

本实验中，模型组炎症细胞因子IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高，而采用附子理中汤干预后，IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均下降，与研究[14-16]的报道一致，提示附子理中汤可能通过影响AQP4进而减轻炎症反应。

SCr、BUN、UCr含量常常用于检测肾功能。报道表明，SCr、BUN、UCr作为早期传统的检测肾功能指标，对于发现肾功能早期改变具有较好的参考价值[17-18]。 SCr、BUN、Ucr过多在体内蓄积在中医学视为肾阳气化功能的不足[19]，《黄帝内经》已指出阳气在人体主要发挥温养、气化、防御等功能，由于脾肾阳虚不能蒸水化气、分清泌浊，致代谢产物SCr、BUN、Ucr水湿浊邪泛滥、潴留体内，有学者通过温补脾肾阳以启水助气化改善肾功能不全[20-21]。本实验中，模型组SCr、BUN、UCr含量升高，提示肾阳蒸腾气化功能减弱，而附子理中汤各剂量组SCr、BUN、UCr含量均有不同程度减低表现为“温阳”作用。

本实验工作结果提示，附子理中汤影响AQP4表达，进而通过AQP4作用，一方面减轻胃肠组织炎症反应，另一方面经由ANP途径调控水液代谢，从而发挥其温阳健脾祛湿作用。