基于微阵列技术分析胚胎停育绒毛组织中的染色体异常

侯东霞 侯丽青 乌云塔娜 周雪原 王晓华 冀小平

内蒙古自治区妇幼保健院（呼和浩特010060）

胚胎停育（embryo damage）是指在胎儿在母体子宫内发育少于20 周即死亡的现象，是常见的恶性围产医学疾病。胚胎停育有正常的早孕表现，可有或无先兆流产症状，可发展为自然流产、不全流产或稽留流产［1］。大约有15%～20%妊娠以早期自然流产而告终［2］，发病率高。造成胚胎停育的原因很多，包括胚胎染色体异常、母体内分泌紊乱、母体免疫失调、精子DNA 完整性和环境因素等［3-4］。其中，染色体异常被认为是最主要的因素。研究表明，约50%的胚胎停育绒毛组织存在染色体异常［5］。G 显带核型分析或免疫荧光原位杂交技术（FISH）是绒毛组织染色体异常检测的常用手段，但两种技术都有一定的局限性。G 显带核型分析需要细胞培养且只能检出染色体数目或大片段的结构异常，FISH 则只能检测有限的染色体数目异常，会漏检一些染色体异常。近几年发展起来的染色体微阵列技术（chromosomal microarray analysis，CMA），只需获得DNA，就可全面、快速的检出全部染色体的数目异常及非平衡性结构异常，即染色体片段的缺失或重复，也称为拷贝数变异（copy number variation，CNV）。本研究基于CMA 分析胚胎停育绒毛组织的染色体异常，不仅分析了以往检测技术能检出的染色体数目异常和大片段结构异常，还分析了小片段的CNV，以及其他罕见的染色体异常类型，更全面的研究了胚胎停育和染色体异常的关系，进一步分析了孕妇年龄、流产次数差异，包含拷贝数在内的染色体异常分布情况。也进一步探讨CMA 在胚胎停育遗传学诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年10月至2020年5月在本院确诊为胚胎停育（包括自然流产和稽留流产），并行清宫术及绒毛组织染色体异常检测的自然受孕孕妇324 例。孕妇年龄为20～43 岁，平均（30±4）岁，孕周6～14 周。患有子宫内膜异位症、子宫肌瘤等影响胚胎着床、发育的，以及男方精子不成熟的胚胎停育患者不纳入研究。本研究经医院伦理委员会批准（2018 伦函审［011］号），所有受检者均已签署知情同意书。

1.2 标本采集及DNA 提取将新鲜绒毛组织标本浸泡在装有无菌等渗氯化钠溶液离心管内，并用大量等渗氯化钠溶液清洗3 次，去除血液等杂物。用组织剪取少部分绒毛组织，并将其剪碎。使用Promega 公司（美国）DNA 提取试剂盒，按照说明书提取基因组DNA。用NanoDrop 2000 分光光度计测定DNA 浓度。

1.3 染色体微阵列检测使用Thermo fisher 公司（美国）CytoScanTMOptima 芯片，按试剂盒说明书操作，将基因组DNA 经酶切、接头连接、PCR、产物纯化、片段化、标记、预杂交之后，杂交液注入芯片，进行过夜杂交。次日，芯片经洗涤、染色和扫描获得数据，用ChAS 软件分析。将基因组拷贝数变异与收录正常人群拷贝数变异的DGV 数据库（http：//projects.tcag.ca/variationriatio）比对，并查询表型数据库DECIPHER（https：//decipher.sanger.ac.uk/）、ClinGene、PUBMED 数据库等，并参考2019年CNV 解读标准［6］进行解读。

1.4 统计学方法应用SPSS 23.0 软件进行数据统计，计量资料采用（）表示；计数资料采用例（%）表示，组间比较应用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绒毛组织染色体异常检出率共收集324 例绒毛组织，采用染色体微整列分析法检测100%成功，检出异常199 例，异常总检出率为61.42%。其中，染色体数目异常172 例，检出率为53.09%。CNV 21例，检出率为6.48%。其他异常6例，检出率为1.85%。199 例异常病例中，染色体数目异常和结构异常分别占比86.43%和10.55%。染色体数目异常以常染色体三体最多（126/199，63.32%）。常染色体三体包含了多重三体6 例、嵌合体三体7 例、嵌合体多重三体2 例。6 例其他异常，包括染色体三体和CNV 合并异常2 例，三倍体基础上的非整倍体2 例（68，XYY，-4 和70，XXX，+16），杂合性缺失（LOH）1 例，异源嵌合（46.XX/46，XY）1 例，异常占比为3.02%。见表1。

表1 胚胎停育绒毛组织染色体异常检出情况Tab.1 Detection of chromosomal abnormalities in fetal villous tissue of embryo damage

2.2 染色体非整倍体分析常染色体三体、常染色体单体、性染色体单体和合并三体和结构异常的病例共159 例，均属于染色体非整倍体。分析这些非整倍体异常中每条染色体的发生异常的频率，见表2。常染色体多数以三体发生常见，少数发生单体。其中，16-三体发生率最高为23.90%（38/159），其次为22-三体（19/159，11.95%）、15-三体（17/159，10.69%）和21-三体（14/159，8.8%）等。性染色体异常以X 单体为常见，发生率为17.61%（28/159）。本次收集的样本中，有19 条出现了非整倍体异常，1、17、19 号常染色体和Y 染色体未发现非整倍体异常。

2.3 低龄孕妇与高龄孕妇染色体异常分布将样本以预产年龄35 岁为界限分为低龄组和高龄组来分析。324 例样本中，低龄组孕妇275 例，平均年龄（29±2）岁，染色体异常164 例；高龄组孕妇49 例，平均年龄（37±2）岁，染色体异常35 例；异常率分别为59.64%和71.43%，高龄组异常率高于低龄组，但两组染色体异常率差异无统计学意义（χ2=2.441，P=0.118）。比较不同类型染色体异常的分布差异，两组间常染色体三体（χ2=14.450，P＜0.001）和CNV（χ2=5.010，P=0.025），差异有统计学意义，见表3。染色体三体在高龄组异常占比高达91.43%，低龄组中为57.32%；CNV 在低龄组中异常占比12.80%，高龄组异常中未发现。常染色体单体、性染色体单体和三倍体在低龄组中分布率均高于高龄组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。各染色体三体在高龄组和低龄组中的分布见图1，13、15、21、22 号染色体在高龄组三体异常占比更高，而16-三体在低龄组占比更高，但差异均无统计学意义（P＞0.05）

表2 各染色体非整倍体异常发生频次Tab.2 The frequency of aneuploid abnormality of each chromosome

表3 高龄孕妇与低龄孕妇染色体异常分布情况Tab.3 Distribution of chromosomal abnormalities in older and younger pregnant women 例（%）

图1 高龄孕妇与低龄孕妇常染色体三体的分布情况Fig.1 Distribution of autosomal trisomy in older and younger pregnant women

2.4 多次胚胎停育染色体异常情况324 例样本中有4 例胚胎停育≥2 次，其中3 例异常，且均为常染色体三体，异常率75%；与单次胚胎停育的染色体异常率（196/320，61.25%）差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 胚胎停育样本中发现的拷贝数变异共检出21 例CNV，通过查询数据库判断其致病性，其中16 例为致病性，3 例为可能致病，2 例为临床意义未明。21 例中有10 例同时发生两个或两个以上位点的CNV。同一病例具有多个致病性不同的CNV 时，以致病性最强的作为评价。按片段长度来分析，有12 例（57.14%）CNV＞10 Mb，全部为致病性变异；2 例（9.52%）CNV 大小在5～10 Mb 之间，为可能致病变异；7 例（33.33%）CNV＜5 Mb，4 例为致病性变异，1 例为可能致病变异。大部分CNV 有与之相关连的疾病报道，这些疾病可导致多种发育问题。21 例病例均未收集到其父母验证结果。见表4。

3 讨论

胚胎停育是妇产科常见疾病，以自然流产或稽留流产为妊娠结局。胚胎停育病因多而复杂，其中染色体异常是公认的最主要的致病因素。流产组织绒毛染色体的检测，是寻找胚胎停育病因的有效手段，不仅能够为生育困难患者提供遗传指导，还有助于推动流产病理学的临床研究。本研究分析324 例胚胎停育绒毛组织样本，显示染色体异常率为61.42%，较大多数早期自然流产、稽留流产等胚胎停育相关文献报道的异常率（50%～70%）［4-5，7-10］偏高。这一结果说明约60%的胚胎停育病例可以在遗传方面找到病因，根据具体的染色体异常将得到有效的生育指导。

表4 胚胎停育绒毛组织中发现的CNVTab.4 The CNVs found in aborted villous tissue of embryo damage

一般染色体异常分为数目异常和结构异常。数目异常是临床上最常见的染色体畸变类型。胚胎停育染色体异常研究报道中染色体数目畸变的异常占比普遍可达90%左右，其中非整倍体三体最多，可达60%以上［5，8-10］，本研究的检出率与之相似。非整倍体主要是由卵母细胞或精子成熟过程中或受精卵早期卵裂过程中染色体不分离或丢失造成的［11］。通常来说，三体最常见且种类最多。除了1 号染色体外，所有染色体的三体都在流产组织中被发现［5］，本研究中1、17、19 号染色体未发现三体。一般16-三体的发生率最高，在自然流产的染色体三体病例中约占20%～30%［5，8-9］。16-三体与胎儿死亡、早产、宫内发育迟缓和胎儿畸形高度相关［12］。发生率较高的还包括22-三体、21-三体和15-三体，13-三体和18-三体发生率也相对较高但低于前述4 条染色体［5，8-10］。本研究中，各染色体异常频次统计显示16-三体发生频次最高，其次为22、15、21、13-三体，但并未发现18-三体。Turner 综合征（45，XO）是性染色体数目异常最常见的类型［8-10］，本研究检出率较其他文献报道稍高，同时并未见其他种类的性染色体异常。但事实上47，XXX、47，XXY、47，XYY 和47，XYYY 在流产绒毛组织中也可被检测到［9-10］。常染色体单体发生率一般较低，本研究偶见18 单体两例和21 单体1 例。整倍性异常也常见于流产绒毛组织中［8-10］，可发生三倍体或四倍体，本研究采用方法仅可检出三倍体。三倍体是致死性的，其形成可能来自于双雌受精或双雄受精。双雌受精是指二倍体卵细胞的受精，通常是由于卵细胞未排出极体或第二极体重新融合到卵细胞；双雄受精即两个精子同时进入了卵细胞［13］。多倍体的发生率远低于非整倍体，这可能与两类异常发生的机制不同有关。

染色体结构异常包括染色体片段的重复、缺失、倒位和易位，在流产组织染色体总体异常中所占的比例约为5%～13%［8-10］，本研究检出为10.55%。结构异常的检出率受到检测方法的影响，一般CMA方法检出率高于传统核型分析。常规染色体核型分析仅能发现＞5～10 Mb 片段的结构异常，而CMA 能检出染色体微小片段（＞100 Kb）的缺失或重复，但无法检出平衡易位或倒位等无DNA 片段缺失或重复的染色体结构异常。本研究检出的21 例结构异常，有7 例缺失或重复的片段＜5 Mb，有4例含有5～10 Mb的片段，这些是常规核型分析方法不能或不易发现的。基于本研究检测结果，在流产组织中CMA 至少能比传统方法多检出33.33%（7/21）的染色体结构异常。本研究中发现的流产绒毛组织的染色体片结构异常多数同时存在重复和缺失，且发生在不同的染色上，形成多重结构异常。根据2019年新版CNV 解读标准［6］，较大片段的缺失重复评分均＞0.99，可以认定其为明确的致病性变异，但本研究中也有5 例可能致病或临床意义不明的小片段缺失或重复病例，需要未来临床数据的进一步积累或相关基因功能的研究来提供证据明确其致病性。

胚胎停育涉及到的染色体异常类型复杂，这些异常包括但不限于染色体三体、单体、多倍体、染色体嵌合、染色体结构重排列及拷贝数变异等［14］。同一病例携多重染色体异常的情况并不少见［8-10］，如本研究中发现的多重三体、三体合并CNV 异常、三倍体非整倍体。此外，LOH 也是胚胎停育的致病原因［15-16］，但较少见，本研究发现1 例。本研究还发现1 例46，XX/46，XY 异源嵌合，也称真两性畸形或开米拉。根据文献资料及本研究的分析结果，使用CMA 方法更大程度上的找出了胚胎停育的遗传学病因。CMA 检测胚胎停育的病因需要更多的临床研究来补充积累，有广阔的发展和创新空间。

随着年龄的增加，女性的流产次数及其胎儿染色体异常率都会随之增高［17］。本研究发现高龄组的染色体异常率（71.43%）远高于低龄组（59.64%），差异主要表现在常染色体三体和CNV 异常上。高龄组的三体比率可达90%。Soler 等在980 例自然流产组织中分析母亲年龄与染色体异常的关系，发现高龄孕妇中染色体异常率显著高于低龄孕妇，异常率从61.3%增加至76.8%［18］。本研究进一步分析了各染色体三体在高、低龄孕妇中的分布，但这可能受到样本量的限制，因此差异均无统计学意义。本研究中CNV 异常在低龄孕妇的染色体异常占比较高，而高龄孕妇中未见此类异常。ZHANG 等［19］报道在胎儿或流产组织中，非整倍体和CNV 的发生率随孕妇年龄的增加而增加。按照一般的认识孕妇年龄越大发生染色体异常机率越高，推测本研究与文献结果相异的主要原因可能是高龄组样本量少，这还需要更大样本量的研究来验证。LEI 等［20］发现孕妇年龄越高，胎儿羊水染色体核型45，X 的发生率反而越低。本研究发现45，X 的发生率同样是在低龄孕妇中更高，但差异无统计学意义。除三体和CNV 异常外的其他几种染色体异常在高龄和低龄比较中差异均无统计学意义，可能和高龄组样本量的较少有关，还需要后期再扩大样本数进行研究，使结果更具有可靠性。

偶发性流产在早孕期是常见的，但连续两到三次的反复妊娠损失的现象并不常见。一些研究称偶发性流产和反复流产其妊娠产物的染色体异常率差异无统计学意义［21］。但也有一些研究声明复发性流产的染色体异常率要低于偶发性流产［5］，因为偶发性流产可认为主要是异常胚胎向生存能力发展的失败，与染色体异常关联更为密切，而复发性流产包含更多的其他病因。综合多个研究结果，反复流产的染色体异常率与自然流产的异常率相似［21-22］。ZHANG 等［23］研究了696 例流产患者反复流产的病因构成，发现两次或三次以上复发性流产的病因构成一致。本研究分析显示单次与多次胚胎停育染色体异常率差异无统计学意义。但因多次胚胎停育样本量较少，所以此次分析结果并不能充分说明多次胚胎停育与单次胚胎停育染色体异常的差异，这也是本研究的不足之处。

综上所述，通过染色体检测可为半数以上的胚胎停育患者找到病因，除了最常见的染色体数目异常，CNV 也是一个重要的致病原因。CMA 作为新兴的分子核型分析技术，能更高效且准确地分析胚胎停育组织染色体的数目和非平衡结构变异，检出传统染色体诊断技术无法检测到的微缺失微重复，提高染色体异常的检出率。未来应该继续研究CMA 对胚胎停育中染色体结构异常的检出率，并积累致病CNV 的数据，为临床提供更加准确和丰富的参考。总之，CMA 技术的应用有利于胚胎停育的临床诊断和指导患者再生育，提高了临床染色体病的诊断水平。