Treg/Th17细胞失衡及相关细胞因子表达水平与再生障碍性贫血的关系分析

王 蕊, 董彩丽, 赵云婷*, 王 艳

(1.河北省第七人民医院检验科, 河北 保 定 0730002.河北医科大学第二医院血液内科, 河北 石家庄 050000)

再生障碍性贫血(Aplastic anemia，AA)是临床上常见的血液系统疾病，主要以骨髓增生及全血细胞减少为特征，表现为出血、贫血及感染倾向[1]。AA发病机制尚不明确，可能与免疫系统异常有关，尤其是CD4+T细胞功能紊乱在AA发病中起到重要促进作用[2]。Treg细胞是一种重要的CD4+T细胞，具有免疫调节、免疫抑制作用，可维持机体自身免疫耐受[3]。Th17细胞也属于CD4+T细胞，具有促炎、诱导自身免疫性疾病等作用，与Treg细胞相互制约，保持动态平衡，以维持机体稳态。有临床研究发现，AA患者外周血Treg/Th17处于失衡状态，认为Treg/Th17失衡是AA发病机制中的重要环节[4]，但关于Treg/Th17细胞失衡及其相关细胞因子与AA疾病程度、预后的关系研究尚少。鉴于此，本研究选取近2年收治的AA患者为研究对象，观察其外周血Treg、Th17、Treg/Th17及相关细胞因子水平变化，旨在探讨外周血Treg、Th17、Treg/Th17水平及相关细胞因子与AA疾病程度及预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2016年12月至2018年6月期间合作医院收治的AA患者为研究对象，纳入标准：①均为初诊再生障碍贫血，结合临床表现、血象及骨髓象进行诊断，符合《血液病诊断及疗效标准》[5]中AA诊断要求；②入组前1个月内未接受相关治疗；③患者对本研究充分知情，并自愿签署病人知情同意书。排除标准：①合并急性感染或其他自身免疫系统疾病者；②合并恶性肿瘤者；③非初诊者；④怀孕或哺乳期女性。纳入研究者共94例，根据Camitta分型标准[6]确定AA严重程度，并将患者分为轻型AA(mild AA，MAA)组和重型AA(severe AA，SAA)组，其中SAA骨髓有核细胞百分率<0.25，若≥0.25但<0.50，则残存的造血细胞应<30%；且具备下列3项中至少2项：中性粒细胞<0.5×109L-1；校正的网织红细胞<1%或网织红细胞绝对值<20×109L-1；血小板<20×109L-1。MAA组41例，其中男性24例，女性17例，年龄15～81岁，平均(48.38±10.49)岁，SAA组53例，其中男性28例，女性25例，年龄14～79岁，平均(49.11±10.98)岁。另选取同期体检健康者50例为对照组，其中男性29例，女性21例，年龄22～69岁，平均(47.71±10.01)岁。各组性别、年龄相似(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准同意。

1.2主要试剂:Cy5标记的抗人CD3和CD4单克隆抗体，FITC标记的抗CD8和CD25单克隆抗体，PE标记的抗人白介素(Interleukin，IL)-17和CD127单克隆抗体均购自美国BD公司；IL-10、IL-6和IL-17酶联免疫吸附试剂盒购自美国R&D公司。

1.3外周血Treg、Th17水平检测:采集受试者外周静脉血10～12 mL于抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，制备浓度为1×106PBMC细胞悬液，取1 mL加入24孔板，再加入20 ng/mL佛波酯、1ug/mL离子霉素、2nmol/mL莫能菌素，于5% CO2，37℃培养箱中放置4h。Treg、Th17采用流式细胞术检测，具体操作步骤见文献[7]。

1.4血清相关细胞因子检测:采集所有受试者外周血4～5mL，不进行抗凝处理，室外静置20min后，3000rpm离心10min，小心收集上清，于-80℃保存。采用酶联免疫吸附法检测血清IL-10、IL-6和IL-17表达水平。

1.5随访:对AA患者进行8～12个月的随访，随访方式为电话或门诊，记录患者预后不良(急性复发或死亡)情况。复发标准：①骨髓细胞增生程度低于正常的1/4；②血小板绝对数<20×109L-1，网织红细胞绝对数<20×109L-1，中性粒细胞绝对值<0.5×109L-1，血象至少具备以上2项。

2 结 果

2.1各组外周血Treg、Th17及Treg/Th17水平比较:各组外周血Treg、Th17及Treg/Th17水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，SAA组Treg细胞水平、Treg/Th17低于对照组和MAA组，Th17水平高于对照组和MAA组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组外周血Treg Th17及Treg/Th17水平比较

2.2各组血清细胞因子细胞因子水平比较:各组血清IL-10、IL-6和IL-17水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，SAA组IL-10水平低于对照组和MAA组，IL-6和IL-17水平高于对照组和MAA组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组血清细胞因子细胞因子水平比较

表3 Treg/Th17细胞失衡及相关细胞因子与AA病情严重程度关系

2.3Treg/Th17细胞失衡及相关细胞因子与AA病情严重程度关系:Treg、Treg/Th17及IL-10水平与疾病严重程度呈负相关(P<0.05)，Th17、IL-6和IL-17与疾病严重程度呈正相关(P<0.05)，见表3。

2.4Treg/Th17细胞失衡及相关细胞因子与AA预后的关系:94例再生障碍贫血患者随访期间24例死亡，急性复发17例，以病情程度(MAA=0、SAA=1)、Treg、Th17、Treg/Th17、IL-10、IL-6及IL-17(连续变量不赋值，按实际值分析)为自变量，以预后情况为因变量(未出现急性复发或死亡=0，急性复发或死亡=1)，采用多元Logitic回归模型进行分析，结果显示，除病情程度以外，Treg和Treg/Th17是不良预后(急性复发或死亡)的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 Treg/Th17细胞失衡及相关细胞因子与AA预后的关系

3 讨 论

AA是一种由多种原因(物理、化学、生物)引起的血液系统疾病，包括遗传性AA和获得性AA，发病机制可能与免疫功能紊乱、造血干细胞缺陷、造血微环境异常等有关。近期越来越多研究认为，AA在某种程度上可看做一种自身免疫性疾病，靶抗原为造血系统，且采用免疫抑制治疗取得一定疗效，也说明AA发病与免疫功能紊乱密切相关[8]。但免疫功能紊乱是如何导致AA发病以及如何影响疾病进展尚未完全明确。

CD4+T细胞是机体免疫功能调控中心，CD4+T细胞水平升高，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例向CD4+T细胞免疫偏移，造血微环境中相关细胞因子分泌异常，最终引起造血功能衰竭[9]。Treg细胞可抑制CD4+T细胞增殖，是调节CD4+T细胞和CD8+T细胞平衡的关键因素，从而维持自身免疫耐受，并发挥抗炎作用[10]。有研究以SAA模型小鼠为研究对象，采用雷帕霉素干预，结果发现雷帕霉素可通过抑制Treg细胞凋亡，恢复小鼠骨髓造血功能，提示上调Treg细胞有助于改善骨髓造血功能[11]。本研究中，SAA组Treg细胞水平明显低于对照组和MAA组，且Treg细胞水平与AA严重程度呈负相关，即Treg细胞水平越低，AA病情越严重。由此可见，AA患者外周血Treg细胞水平明显下调，且通过监测Treg细胞水平可判断病情严重程度。进一步分析发现，AA患者IL-10水平明显降低，提示患者Treg细胞免疫功能受到抑制，分析原因可能在于IL-10是Treg细胞分泌的细胞因子，IL-10具有抗炎作用，并可抑制γ-干扰素、TNF-α生成，进而调控自身免疫性疾病，但具体机制仍需深入探究。

Th17细胞是一种新发现的CD4+T细胞亚群，其主要通过分泌IL-6、IL-17等细胞因子使更多炎症细胞聚集于靶区，对造血干细胞造成损伤，诱导其凋亡，或通过分泌细胞毒性物质直接损伤造血干细胞[12]。因此我们认为Th17、IL-6、IL-17可能与AA患者免疫功能紊乱有关，分析发现，SAA组Th17、IL-6、IL-17水平均明显高于对照组和MAA组，且与疾病严重程度呈正相关，证实SAA患者Th17及其相关细胞因子水平明显上调，推测与Th17细胞介导炎症反应，使机体出现免疫亢进有关。相关荟萃研究显示，当Th17分泌大量IL-6后，IL-6可进一步促进初始CD4+T细胞分化为Th17，同时通过抑制Foxp3表达影响Treg细胞功能，所以Treg/Th17细胞失衡可能是由细胞因子水平失调造成[13]。郝慧琴[14]等研究发现，系统性红斑狼疮患者Th17水平明显高于健康者，Treg细胞水平明显低于健康者，认为T17/Treg比值是系统性红斑狼疮病情评估的重要参考指标。由此认为，Treg/Th17失衡可引起自身免疫疾病发生。本研究结果显示，SAA组Treg/Th17低于对照组和MAA组，且与国外学者Li[15]等研究结果相似，均表明Treg/Th17失衡与AA尤其是SAA有紧密关联。基于以上分析，本研究通过进一步Logitic回归模型分析Treg/Th17与AA预后的关系，发现除病情程度以外，Treg和Treg/Th17是急性复发或死亡的独立危险因素，主要原因在于Treg/Th17失衡程度与病情程度相关，因此认为监测Treg/Th17水平对于预测疾病严重程度和疾病预后具有重要参考价值。但本研究样本量有限，影响AA的预后因素可能还与临床治疗及患者的个体差异有关，相关论点仍有待进一步论证。

综上所述，Treg/Th17细胞失衡在AA疾病发生机制中起到重要作用，在AA患者机体中，Treg细胞免疫应答减弱，Th17细胞免疫应答增强，Treg/Th17向Th17细胞免疫应答偏移，且Treg/Th17失衡越严重，AA病情越严重，预后越差，可能为临床监测、诊治提供新的途径。