Beclin1调控的自噬在胚胎碎片形成中的作用及机制研究

牛焕付, 牛姝方, 魏泽锋, 于春娜, 金真真

(济宁医学院附属医院生殖医学中心， 山东 济宁 272029)

胚胎碎片是评价卵裂期胚胎形态的重要参数，高比例碎片可能是导致胚胎凋亡的重要诱因，也会影响胚胎发育或种植潜能[1]。胚胎碎片产生原因众多，自噬过程被认为是影响胚胎碎片的主要原因，而Beclin1激活液泡分类蛋白34，促使复合体和自噬体形成则为研究相对较多的基础机制[2,3]。但是Beclin1不仅参与了自噬的启动过程，还对胚胎适应压力、体外发育、退行性病变等生理病理过程具有一定影响，深入探究Beclin1调控的自噬过程对胚胎碎片的具体影响，可为清除碎片提高胚胎的发育潜能提供参考依据及理论支撑[4]。

1 对象与方法

1.1研究对象：选择2016年7月至2019年10月我院行取卵体外受精的患者240例，诊断标准：原发不孕为婚后夫妇同居3年及以上，女方没有采取避孕措施而未能受孕。纳入标准：35岁以下；不孕病因均为内分泌功能失调；近15d无严重的生殖系统炎症；尚未接受系统治疗。排除标准：染色体异常或生殖系统发育畸形；有严重器质性障碍或原发性损害；伴发其他自身免疫性疾病患者[5,6]。两组患者基本情况构成差异均无统计学意义(P>0.05)，两组患者均衡性好，可比性高，见表1。

1.2分组方式:拾卵即时复检，将细胞数大于6的患者胚胎纳入研究范围，排除受精胚胎(2PN、OPN或1PN)，选取胚胎(3PN)而后根据碎片含量不同，细分为如下四组：低碎片组(碎片比例<10%)、中低碎片组(25%>碎片比例≥10%)、中高碎片组(50%>碎片比例≥25%)、高碎片组(碎片比例≥50%)[7]。

1.3干扰方式:使用G2囊胚培养液对所选胚胎进行培养，具体方法为：将其放置于35mm培养名中，覆盖适量矿物油，而后将其置于合适环境中(37℃、6.5%、CO2)进行培养。使用干扰素(浓度40ng/mL)进行体外刺激和干扰，持续36h，最后收集细胞用于后期各项指标的定量检测。

表1 各组患者基本情况

1.4检测指标:采用免疫印迹法定量检测相关蛋白含量，细胞中加入蛋白裂解液RIPA(135μL)进行匀浆裂解，高速离心(11000r/min)后获取上清液，依次经过电泳、转膜、封闭、过夜、洗膜、孵育等步骤，加入免疫印迹化学发光试剂进行检测。检测指标具体包括：Beclin1蛋白、PI3K蛋白、LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白。

2 结 果

2.1四组患者干扰前后Beclin1相关蛋白含量比较:干扰前后比较，四组患者Beclin1蛋白、PI3K蛋白含量均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。干扰前比较Beclin1蛋白或PI3K蛋白含量，从高到低依次为：低碎片组、中低碎片组、中高碎片组、高碎片组，差异均有统计学意义(P<0.05)。干扰后比较，四组患者Beclin1蛋白、PI3K蛋白含量的差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 患者干扰前后Beclin1及相关蛋白含量比较

2.2四组患者干扰前后自噬相关蛋白含量比较:干扰前后比较，四组患者LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白含量均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。干扰前比较LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白含量，从高到低依次为：低碎片组、中低碎片组、中高碎片组、高碎片组，差异均有统计学意义(P<0.05)。干扰后比较，四组患者LC3B蛋白含量的差异有统计学意义(P<0.05)，而mTOR蛋白、AKT蛋白含量的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.3四组患者干扰后Beclin1与PI3K、LC3B、mTOR、AKT的相关性:Beclin1与PI3K、LC3B、mTOR、AKT，分别进行相关性分析，其相关性均有统计学意义(P<0.05)，具体为：PI3K(r=0.814，P<0.05)、LC3B(r=0.592，P<0.05)、mTOR(r=0.687，P<0.05)、AKT(r=0.716，P<0.05)。

表3 患者干扰前后自噬相关蛋白含量比较

3 讨 论

胚胎碎片产生机制的说法众多，包括化生学说、诱导学说、遗传学说、免疫学说等。但是胚胎碎片对胚胎发育的影响确是公认且统一的，即过多胚胎碎片可导致胚胎胞浆中细胞器减少，致使供能物质不足，并降低胚胎之间连接的紧密性，从而增加胚胎染色体非整倍体异常的风险，最终降低胚胎囊胚形成概率[8]。考虑到胚胎碎片对胚胎发育具有重要且深远的影响，诸多学者对其进行了深入的基础研究，旨在通过有效、安全的方法降低或避免胚胎碎片产生。

本研究发现，干扰后患者Beclin1、PI3K、LC3B、mTOR、AKT蛋白相比干扰前，其含量具有明显增加，说明人为干扰可产生机械损伤的效果，严重刺激胚胎发育和扩张过程，通过多种通道诱导特征性蛋白的表达，进行性增加胚胎碎片的含量或比例。同时，干扰前6项蛋白含量从高到低依次为：低碎片组、中低碎片组、中高碎片组、高碎片组，4组之间蛋白表达含量差异显著，说明高比例胚胎碎片能产生和干扰素相同的影响，即诱导特征性通道蛋白高水平表达，甚至促进胚胎凋亡的发生。

研究还发现，四组患者干扰后Beclin1、PI3K、LC3B蛋白含量差异显著，分析原因，干扰素和胚胎碎片可能会产生一定叠加效应，极大促使特征通道蛋白的表达及功能显现[9]。根据既有研究，Beclin1蛋白、PI3K蛋白、LC3B蛋白、mTOR蛋白、AKT蛋白联系较为密切的通道包括PI3K/Akt/GSK3β、PI3K/mTO、mTOR/β-TrcP/Nrf2等，胚胎碎片具体通过何种路径或多种路径影响上述蛋白表达，也有待基础研究进一步验证。同时，Beclin1与PI3K、LC3B、mTOR、AKT相关性均有统计学意义，初步证实Beclin1调控的自噬过程为启动因子，对胚胎碎片产生、分布可能均有不利影响。Beclinl作为真核细胞自噬过程的关键调节因子，既是自噬启动的标志物，又是评估自噬严重程度、自噬活性的定量标记物[10]。简单来说，Beclin1可通过调控相关蛋白表达来促进多步骤分解代谢途径，从而启动Ⅱ型程序性细胞死亡过程。考虑到胚胎碎片对其发育过程的具体影响，我们推测Beclin1调控自噬过程旨在清除不必要的细胞产物，从而将产生的营养物质释放入细胞质中，进而为应激状态下的胚胎细胞提供能量，并促使能量代谢转化过程[10,11]。具体分析通道蛋白与其他特征蛋白的关联，首先，Beclinl基因下调或变异可能会介导异位内膜细胞自噬行为，促使异位子宫内膜细胞黏附于其他细胞外基质，导致异位内膜快速凋亡[12]。其次，Beclinl的N端Bcl-2同源3结构域参与了LC3B、mTOR邓家族蛋白的相互作用，失控的Beclinl基因可进行性增加相关位点癌蛋白浓度，从而激发细胞自噬过程。