快速现场评价技术在肺隐球菌病诊断中的实时性和准确性

叶玲 洪苓苓

肺隐球菌病（Pulmonary cryptococosis，PC）是一种由隐球菌感染引起的急性或亚急性肺部真菌病，隐球菌主要经呼吸道进入体内，肺是隐球菌感染的首发部位，中枢神经系统最易受累，是一种常见的机会感染性疾病，好发于免疫功能低下者，但在免疫力正常的患者中，若合并相关易感因素者也可出现[1，2]。研究报道显示，肺隐球菌病患者的临床表现可以无症状，也可以表现为致死性的感染[3]。而在影像学上，PC 可因免疫功能的差异出现各种影像学表现，以肺部单发或多发的周围型的结节团块及局限的肺炎样病灶最为多见，约占66%，其次还可表现为弥漫的、播散的肺炎样浸润和实变，可形成空洞和晕征，亦可表现为网格状浸润、肺门纵隔淋巴结肿大、胸腔积液、弥漫性粟粒影及磨玻璃样渗出等[4]。

隐球菌抗原检测是诊断PC 的一种无创、快速、有效的实验方法，其次为病原学检查，可常规行支气管镜下毛刷及BALF 直接镜检或培养，但阳性率不高，因此，组织病理学检查是确诊肺隐球菌病的“金标准”，其病理改变为典型肉芽肿性病变（非干酪样），通过特殊染色（墨汁染色、PAS 染色、六胺银染色等）可明显提高隐球菌的检出率。

快速现场评价（rapid on-site evaluation，ROSE）是目前呼吸介入病学中不可缺少的一部分，它可以在支气管镜检查、肺穿刺等介入操作过程中由细胞或微生物病理学专业人员对穿刺标本进行现场制片和染色并快速评价，向操作者反馈穿刺是否成功，减少不必要的穿刺，提供初步诊断[5，6]。ROSE技术包括快速现场细胞学评价（C-ROSE）和快速现场微生物学评价（M-ROSE），临床上C-ROSE 应用范围更广，M-ROSE 则更多地应用于真菌感染疾病的诊断，由于微生物大多需要特殊染色，临床上确诊时间被拉长，而M-ROSE 则通过其独有的实时性及高准确性在肺部特殊感染的诊断中具有优势，本研究通过对比我院近2 年肺隐球菌病患者的诊治过程，探讨M-ROSE 联合肺活检对疑诊肺隐球菌病的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料回顾性分析我院近2 年收治的经病理确诊为肺隐球菌病的患者资料。纳入标准：①术前已行胸部CT 平扫+增强显示肺部单发或多发的结节团块影或肺炎样病灶，但经正规抗感染治疗无效；②综合分析患者的病史、辅助检查结果后高度怀疑肺隐球菌病；③术前完善检查，排除肺活检相关禁忌证；④术前告知患者及家属操作过程及相关风险并签署知情同意书。排除标准：①存在凝血功能障碍、严重心、肺功能衰竭等手术禁忌证；②不能获取完整临床资料者。共收集4 例肺隐球菌病患者，其中男1 例，女3 例，年龄26～53 岁，平均42.2岁。其中，慢性乙型肝炎1 例，精神分裂症1 例，系统性红斑狼疮1 例，无基础疾病1 例。肺部影像学多表现为多发结节或肺炎样病变（见图1）。所有病例结核菌素试验、结核感染T 细胞检测均阴性，隐球菌荚膜抗原阳性3 例，阴性1 例，所有患者均已行M-ROSE 且最终均经病理确诊。

1.2 研究方法

1.2.1 CT 引导下肺穿刺过程 术前常规镇静、镇痛，监测生命体征，阅片评估，定位后CT 引导，18G 半自动活检针、同轴引导活检针穿刺切割获取病变组织，呼吸科医师现场进行制片、染色及快速评价，随后将几乎无损失的剩余组织固定后送检病理，穿刺结束后记录ROSE 判读结果所需时间。

1.2.2 M-ROSE 过程 取材后由经正规培训后的呼吸科医师现场制片：取材后组织滚片，迪夫快速染色（A 液20s，B 液30s），显微镜下根据细胞学特征行快速现场评估，若M-ROSE 结果为阳性则继续原位取材，若M-ROSE 结果为阴性则调整后再次取材，记录当时M-ROSE 阳性结果的判读时间。现场阅片结果判定标本满意，记录ROSE 诊断结果及具体时间，结束操作（见图2）。

1.3 诊断结果的判读以CT 引导下肺穿刺术后送检的组织标本所获得明确的病理结果为最终诊断，本研究中病例标本的病理PAS 染色后均可见隐球菌孢子，可以明确诊断肺隐球菌病（见图3）。

图1 4 例肺隐球菌病患者的胸部CT 表现，其中有空洞、结节、实变影等表现

图2 肺隐球菌病的ROSE 表现（×200，箭头所示为隐球菌孢子）

图3 肺隐球菌病的病理表现（×400，箭头所示为隐球菌孢子）

1.4 穿刺标本合格性判断若某一标本在镜下可见明显特殊细胞，则认为该穿刺标本合格；若患者的组织学标本见大量红细胞、坏死细胞、呼吸道粘膜细胞，则认为该穿刺标本不合格。隐球菌快速迪夫染色（Diff-quik stain）后镜下可见菌体，圆形或椭圆形，直径5～25μm，镜下似空泡，有厚壁荚膜，荚膜可比菌体大1～3 倍，亦可见芽生孢子[7]。菌体和孢子多存在于肉芽肿和巨噬细胞中（见图2）。

1.5 统计学方法以SPSS 22.0 统计软件进行统计分析，计量资料比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 诊断准确性所有患者肺穿刺术后的病理学结果即为患者的最终诊断，现场M-ROSE 的报告与病理结果的符合率为100%，ROSE 对肺隐球菌病的诊断敏感度为100%。目前暂无阴性结果。

2.2 诊断实时性4 例肺隐球菌病患者ROSE 口头判读时间为5min、9min、6min、9min，平均时间为7.25min，出具报告的时间为30min、50min、33min、58min，平均为42.75min，病理结果最终报告的时间为取材后78h、72h、72h、88h，除去外送病例的病理结果时间，平均病理报告时间需要77.33h，两组之间对比差异有统计学意义（t=-14.283，P＜0.05）。

2.3 并发症的比较CT 引导下肺活检术已基本成熟，常见的并发症多为咯血、气胸、纵隔气肿、心律失常、低血压、发热等，本研究的患者均无明显并发症。

3 讨论

近年来，由于抗生素、激素、免疫抑制剂、细胞毒性药物的大量使用导致机体免疫功能缺陷，所以PC 患者已逐年增加，但也有报道称 50% 的 PC 患者可以为免疫功能正常的人群，且临床表现轻微，也是导致临床上PC 诊断困难的重要因素[8]。病理结果已成为PC 的确诊依据，而在早期或者高度疑似病例，隐球菌抗原检测（胶体金免疫层析法）可作为筛查，其中胶体金免疫层析法比乳胶凝集法和酶联免疫法具有更高的准确性，其敏感性和特异性可达91.67%和99.61%，且在室温下稳定，10min 即可出结果[9]，本研究中ROSE 口头报告平均时间为7.25min，且与病理结果的符合率达100%，由于样本量较少，二者之间差异是否具有统计学意义尚需进一步研究。

随着呼吸介入及快速染色技术的崛起，快速现场评价技术的价值与优势越来越突出，已经逐渐渗透到临床中并广受欢迎，尤其是对介入呼吸病学的诊断方面[10,11]。ROSE 主要包括制片、染色和阅片三个步骤，研究表明，通过短期学习，普通临床、医技工作者都可掌握ROSE 的快速制片染色方法，但ROSE 的阅片判读才是现场评估的重点。在国外，曾有报道由生物医学科学家帮助判读ROSE 结果，但因其成本较高而无法推广，目前处于尝试阶段[12]。2014 年Chest 杂志发表的一项研究表明，肺科医师经过3 个月的细胞病理学知识培训后，进行ROSE 判读，准确率达80%，与细胞病理学家92%的准确率相比，未见统计学差异[13]。在国内，由冯靖教授及其团队对呼吸介入ROSE 的开展和推广起到极其重要的作用，其中的成人C-ROSE 与术后病理诊断符合率近100%，M-ROSE 中结核病与病理诊断符合率约70%，真菌感染临床符合率超过90%[14～16]。本研究结果表明ROSE 报告及最终病理结果的一致率达到了100%，而且ROSE 可明显缩短肺隐球菌病的诊断时间，能尽早开始抗真菌治疗，减轻患者的经济负担，值得临床推广。

目前，对于M-ROSE 可进行的染色方式有[17]：①迪夫快速染色：它是在瑞氏染色基础上加以改良所形成的一种极快速染色方式，耗时仅50s，多数情况下1min 内就可以在显微镜下观察。这种染色通常用于绝大多数C-ROSE 与M-ROSE，是ROSE 最常用的染色方式，也是现阶段WHO 唯一推荐的标准ROSE 染色方法[18]。②极快速改良乳酸染色，主要应用于各类真菌。③快速支原体 DNA 霍氏荧光染色，主要应用于支原体感染。④快速金-罗耐酸菌荧光染色，主要应用于抗酸菌如结核分枝杆菌、奴卡菌、军团菌。⑤试剂盒化快速革兰染色，主要应用于球菌和杆菌。

M-ROSE 的优势不仅体现在微生物形态学方面，还可以提供明确的细胞学背景。研究表明，中性粒细胞和巨噬细胞是机体对抗肺部细菌感染的主要防御机制，因此，中性粒细胞、巨噬细胞或淋巴细胞吞噬细菌现象对感染性疾病的微生物病原有明确的提示意义[16]。采用 BALF 快速制片结合M-ROSE 在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞吞噬细菌方面可以获得较高的阳性率，这也提示了M-ROSE在呼吸介入病学应用中的重要地位[13]。

综上所述，本研究通过总结分析4 例肺隐球菌患者的诊断和治疗经过，表明ROSE 技术在肺隐球菌病理诊断中具有快速准确的优势，优于隐球菌荚膜抗原的检测，临床意义重大。本研究仍存在不足，由于我科ROSE 技术开展尚早，病例样本量不大，需继续收集符合纳入标准的样本进一步证明ROSE快速诊断的优势，此外，由于医院条件及设备的限制，现场制片及染色之间存在一定的时间浪费，导致ROSE 报告时间延长，有望进一步缩短报告出具时间，上述两点不足之处需要更多的实践进一步探讨及改进。