以‘红巴拉多’为母本的胚挽救育种研究

张晓涵，田淑芬*，张娜

（1. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2. 天津市农业科学院果树研究所，天津 300381；3. 天津农学院，天津 300384）

无核鲜食葡萄由于其食用方便、口感独特，受到了世界各地消费者的喜爱。1995年，董新平[3]利用赤霉素处理有核葡萄的花序，出现了无核性状的葡萄。相较于二倍体葡萄来说，三倍体葡萄无核、果粒大，食用方便方面更具优势[1]，是育种工作者培育无核葡萄的主要途径之一。三倍体葡萄在培育的过程中往往会发生胚的败育现象，而不能正常结实。胚挽救育种是获得三倍体无核葡萄的主要方法[2-5]，利用胚挽救技术可提高后代杂交胚的成活率。1993年，山下用四倍体和二倍体杂交，取其杂交胚进行人工培养获得了三倍体的试管苗，但并未对杂交株进行进一步的结实研究。目前，成功培育出的三倍体葡萄品种有‘夏黑’（Summer Black）、‘尾玲’（Yileyi）、‘蜜无核’（Honey Seedless）、‘早红’（Earlyred Seedless）等[6-8]。二倍体葡萄‘红巴拉多’是极早熟的欧亚杂种，具有皮薄肉脆、果穗大、不掉粒的特点[9]。本试验以其为母本，四倍体葡萄‘户太八号’‘巨玫瑰’为父本培育三倍体葡萄，探究不同的取样时期、胚发育天数及不同父本对其胚挽救结果的影响，提高杂种胚后代的发育率和萌发率，以获得无核、大粒、耐贮运的葡萄新品种。

1 材料与方法

1.1 材料

试验亲本选自天津市农业科学院现代农业创新基地，于2015年定植。试验于2019年3月开始在天津市农业科学院现代农业创新基地、天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室进行。亲本倍性及杂交组合如表1所示。

表1 胚挽救杂交组合及亲本倍性Table 1 Embryo rescue hybrid combination and ploidy of parents

1.2 方法

1.2.1 田间杂交

于2019年4月进行父本花粉的采集，待大部分花穗中的小花蕾开放5%左右时，将其整穗剪下并用镊子剥取花药。待花药自然阴干后加入干燥剂（变色硅胶）放入4 ℃冰箱保存备用。在母本‘红巴拉多’开花前3～4 d进行人工去雄，每种组合杂交10穗。于去雄后第2天开始授粉，连续授粉3 d。每次授粉后的花穗套袋，并标注杂交组合及授粉时间。

1.2.2 幼果采集与消毒

杂交幼果于授粉后45 d、52 d、59 d和66 d分别取样，共计4次。将采下的幼果去除果柄，用洗洁精清洗果实表面后放入流水中冲洗10 min，冲洗过的幼果置于超净工作台进行消毒，先用75%酒精浸泡30 s，用无菌水冲洗3次，再放入2%次氯酸钠中浸泡3 min，用无菌水冲洗3次。

1.2.3 胚珠的发育培养

将杂交幼果置于超净工作台中，用解剖针将胚珠取出，接种在发育培养基（Nitsch＋1.5mol/L IAA＋0.5 mol/L 6-BA＋0.5 mol/L GA3）中，并添加60 g/L蔗糖、5 g/L 琼脂和1 g/L 活性炭，调pH至5.8。

1.2.4 胚的萌发培养

在胚珠发育培养60、90、120 d后，进行胚的萌发培养，用解剖针剥取胚接种到萌发培养基（WPM＋0.2 mg/L 6-BA）中并添加30 g/L蔗糖、5 g/L琼脂及1.5 g/L活性炭进行发育培养，调pH为5.8。培养30 d后进行数据统计，统计方法如下：

胚发育率/%＝(发育胚数/接种胚珠数)×100胚萌发率/%＝(萌发胚数/接种胚珠数)×100采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（P＜0.05）

2 结果与分析

2.1 不同取样时期对胚挽救结果的影响

如表2所示，发现‘红巴拉多’ב户太八号’的杂交胚在45 d取样时胚发育率最高，胚发育率在52 d最高达到25%，胚发育率在66 d最高为11%。而‘红巴拉多’ב巨玫瑰’杂交胚的发育率和萌发率都在授粉后59 d取样达到最高分别为26%和14%。

2.2 胚发育培养天数对胚萌发率的影响

试验中将胚分别发育培养60 d、90 d、120 d，观察其胚萌发率，如表3所示。结果发现‘红巴拉多’ב户太八号’的杂交胚在培养90 d时胚萌发率高于其他两个时期，而‘红巴拉多’ב巨玫瑰’杂交胚达到最大胚萌发率的培养天数较长，为120 d。

2.3 不同父本对胚挽救结果的影响

从表4中可以看出，以‘红巴拉多’为母本，通过对比胚发育率和萌发率，‘巨玫瑰’要比‘户太八号’对于母本的亲和性高，杂种胚生命力强，胚发育率及萌发率可分别达到26%和14%。但‘红巴拉多’ב户太八号’形成的胚珠数量明显高于‘红巴拉多’ב巨玫瑰’。

表 2 不同取样时期对胚挽救结果的影响Table 2 Effect of different sampling time on embryo rescue

表 3 不同胚培养天数对胚萌发率的影响Table3 Effect of different training dates on germination emberyo

表4 不同父本对胚挽救结果的影响Table 4 Effect of different male parent genotypes on embryo rescue

3 讨论与结论

获得三倍体无核葡萄最有效的方法是通过二倍体与四倍体葡萄杂交。在二倍体与四倍体的杂交实验中，以二倍体为母本的组合，胚珠萌发率普遍高于以四倍体为母本的组合[10-12]。由于不同倍性父母本的遗传背景不同，导致其具有遗传差异，因而导致杂交障碍[13]，会使杂种胚在未成熟前发生败育，胚挽救技术是克服这一障碍的有效手段，从而获得大量的杂交后代。杂交胚珠的取样时期是胚挽救成功的重要因素，郭修武等[14-15]发现最佳取样时期与母本成熟期有很大关系。本试验以二倍体葡萄‘红巴拉多’为母本，发现当父本为‘户太八号’时获得的胚珠数量较多，且在授粉后45 d胚发育率最高，但萌发率为0，其原因可能是由于胚发育不够成熟，过早取样的胚生命力弱导致其不能萌发。‘红巴拉多’ב巨玫瑰’的杂交胚在授粉后59 d时接种，胚发育率和萌发率都是最高，为其最佳的取样时间。因此推测不同父本对取样时间也有一些影响，这与徐海英等[11,16]的结果有差异，还需进一步研究。除取样时期外，胚的发育天数对胚的萌发率也有一定影响。本试验研究表明，‘红巴拉多’ב户太八号’的杂交胚，胚发育培养90 d时的胚萌发率明显高于其他两个时期，为最佳的胚发育培养时间。‘红巴拉多’ב巨玫瑰’的杂交胚，胚萌发率随培养天数的增加呈递增趋势，其最佳胚发育培养天数还有待进一步研究。