混合菌株顺序发酵对葡萄酒质量的影响

孔祥君，任同同，许维娜,3*

（1. 烟台迈百瑞国际生物医药有限公司，山东烟台 264006；2. 滨州医学院药学院（葡萄酒学院），山东烟台264003；3. 烟台张裕集团有限公司/山东省葡萄酒微生物发酵技术重点实验室，山东烟台 264001）

混菌发酵是指利用两种或两种以上的微生物，联合完成某种发酵过程的新型技术，是在单菌株纯培养发酵技术上的创新[1]。在葡萄汁发酵为葡萄酒的过程中，不同酵母菌发挥的作用是不同的，通常混菌发酵能使发酵产品表现出更好的特性[2]。多酵母混合发酵可利用菌株之间的协同作用，使发酵底物的利用率增高、发酵产率提高，并可产生、增强一些有益风味的化合物，如酯类、挥发性酚类等，或者降解某些不良气味物质如乙醛、乙酸等，从而改善葡萄酒的风味特征，使发酵酒风味更加丰富、浓郁[3-6]。混菌发酵并不是几种酵母菌株的随意组合，要选择在发酵中能产生明显互利互补作用的菌株。此外，各种酵母菌株的接种比例和接种顺序也会对发酵酒质量产生影响，例如，赵芳琴等[7]发现将梅奇酵母（Mstschnikowia）和酿酒酵母（Saccharomyces）按1∶1的接种比例进行混菌发酵，可有效提升‘美乐’低醇葡萄酒的香气品质；许维娜等[9]发现，速度型酿酒酵母与风味型酿酒酵母接种比例为1∶4时，葡萄酒的香气更加丰富、浓郁，酒的感官质量最好；曾朝珍等[9]研究发现，先接种异常汉逊酵母24 h后接种酿酒酵母，发酵的苹果白兰地风味物质最复杂，品质及风味最好。

目前，针对葡萄酒混菌发酵的研究多采用酿酒酵母与非酿酒酵母 [如有孢圆酵母（Torulaspora）、梅奇酵母、有孢汉逊酵母（Hanseniaspora）、隐球酵母（Cryptococcus）、毕赤酵母（Pichia）、假丝酵母（Candida）等] 混合发酵[4-6,10]，但很多非酿酒酵母的发酵产品存在一些食品安全隐患[8]，采用不同种类、优势互补的酿酒酵母进行混菌发酵，将获得更安全的产品。

本研究采用两株野生酿酒酵母，即速度型发酵酵母和风味型发酵酵母进行混合发酵，将两酵母按照不同的顺序接种到葡萄汁中，通过比较分析各发酵液样品的基础理化指标、风味物质含量、感官质量得到最优的菌株接种顺序，从而探索较佳的混菌发酵工艺，酿造出具有更高品质的葡萄酒。

1 材料与方法

1.1 样品来源

酿酒酵母S2，速度型发酵菌株，分离自烟台大柳行葡萄基地；酿酒酵母F6，风味型发酵菌株，分离自平度大泽山某葡萄基地；酿酒葡萄‘蛇龙珠’取自烟台蓬莱某葡萄园，压榨取汁。葡萄汁的总糖220 g/L，pH 3.57，总酸5.8 g/L。

表1 两种酵母的接种量与接种时间Table 1 Inoculation volume and time of two yeasts/(cfu/mL)

1.2 主要试剂和设备

葡萄糖、琼脂、氢氧化钠、斐林A液、斐林B液，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母粉，英国OXFID公司；盐酸、NaCl试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司；3-辛醇，山东天海有限公司。

UV1800紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器有限公司；TSQ8000Evo气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司；附温度计密度瓶，上海垒固仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母种子液制备与浓度测定

将斜面保藏的酿酒酵母S2和F6分别单独接种到配置好的新鲜YEPD液体培养基中，25 ℃恒温震荡培养24 h进行活化，按5%接种至葡萄汁中，再25 ℃恒温震荡培养24 h，重复2次得到种子液。

酵母种子液适度稀释后，用紫外分光光度法测定其吸光度值（OD600）。酵母菌浓度的计算公式：酵母菌浓度/(cfu/mL)＝OD600×稀释倍数×107，以此为依据计算接种量。

1.3.2 接种与发酵

酵母菌S2与F6的接种比例为1∶1，接种总菌浓度为2×106cfu/mL。共设6个试验组，接种方法如表1所示。设置同时接种组（处理1、2）、优先接种速度型发酵菌组（处理3、4）、优先接种风味型发酵菌组（处理5、6）。每个试验设3个平行，24～26 ℃进行发酵。

发酵开始后，每天检测比重、CO2失重量，待上述指标基本稳定，不再发生变化时结束发酵。将发酵液过滤澄清后进行倒罐。

1.3.3 发酵液基本理化指标检测

发酵完成倒罐澄清后获得发酵液进行理化指标检测。总糖与还原糖测定采用斐林滴定法，总酸的测定采用酸碱滴定法，酒精度的测定采用密度瓶法[11]。

1.3.4 发酵液香气成分检测

发酵液中香气物质成分分析采用固相微萃取-气相色谱/质谱法（HS-SPME-GC/MS）[12-14]。从各酒样中分别吸取5 mL放入萃取瓶中，添加1.5 g氯化钠、200 μL浓度为100 mg/L的3-辛醇，45 ℃水浴平衡30 min。将进样器萃取针插入瓶内萃取50 min，待吸附平衡后将进样器插入气相色谱进样口解析10 min，开始GC-MS检测。GC条件为：载气He；流速1.2 mL/min；分流进样，进样比1∶1.5；进样量10 μL；检测器温度250 ℃；进样口温度250 ℃。MS条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，质量扫描范围30～500 m/z。

分离到的香气成分质谱数据结合计算机图谱库NIST11、相同色谱条件下该物质的标准曲线进行定量分析，采用3-辛醇做内标物质。再根据样品保留时间确认每个香气物质的化学成分。对于没有标准化合物的定性目标峰，采用与目标香气物质化学结构和分子量相近的化合物的标准曲线计算，得出的峰面积与3-辛醇面积进行对比，得到其质量浓度。

1.3.5 感官评价

参照GB 15038-2006中的香气评判方法[15]，由13名品酒员组成品评小组对发酵液进行外观、香气、口感三个方面的综合感官评价，其中外观包括澄清度和挂杯（10分）、色泽（10分），香气包括香气特性（20分）、协调性（20分），口感包括口感特性（20分）、协调性（20分）。

表2 发酵样品理化指标Table 2 Physicochemical indexes of fermented samples

2 结果与分析

2.1 理化指标分析

各发酵液样品的总糖、还原糖、总酸和酒精度测定结果如表2所示。所有发酵样品的残糖均在3.17～3.83 g/L，总酸在4 g/L左右，酒精度在12.08%～12.67%。总体而言，同时接种组和优先接种速度型发酵菌组发酵效率略高。

2.2 香气物质检测结果

通过HS-SPME-GC/MS的方法对样品中香气物质进行分析，共检测出36种香气成分，大致分为酯类（19种）、酸类（9种）、醇类（6种）、醛类（2种）4大类。不同酒样所含的香气物质的种类和含量均有差异。

酯类化合物是葡萄酒中重要的挥发性有机物质，其比例协调对葡萄酒香气有正增效作用[16-17]。如表3所示，6个样品中共有19种酯类物质被检出，其中处理1～6各检出11、10、11、11、11、9种。癸酸乙酯、9-癸酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯在各样品中的含量相对较高，它们都主要呈现花果香气，其中含量最高的癸酸乙酯贡献果香香气[18-19]。酯类物质总含量最高的为处理3，其次为处理5、6、4，同时接种组（处理1、2）的酯类物质含量相对较低。

酸类物质主要使葡萄酒呈现出一些粗糙、不愉悦的气味，然而，它能抑制芳香酯的水解，并起到平衡酒体的重要作用，因此对于香气平衡具有重要作用[20]。如表4所示，6个样品中共有9种酸类物质被检出，处理1～6各检出8、3、6、5、4、4种，酸类物质种类与含量最高的为处理1。各发酵液样品中含量较高的酸类有辛酸、月桂酸、癸酸，主要赋予葡萄酒水果香气、月桂油味等气味[21]。整体而言，各样品中酸类物质含量较低（低于20 mg/L），会对葡萄酒香气产生良好的影响[8]。

表3 酒样中酯类物质含量Table 3 Contents of esters in wine samples/(mg/L)

表4 酒样中酸类物质含量Table 4 Contents of acids in wine samples/(mg/L)

葡萄酒中的醇类物质来源于葡萄浆果或在酒精发酵期间产生[22]。高级醇主要为葡萄酒贡献植物类香气，适当浓度的高级醇能够增加葡萄酒香气的复杂度和协调性，使酒体醇厚、丰满[23]。如表5所示，6个样品中共有6种醇类物质被检出，其中处理1～6各检出6、4、6、5、4、4种。各发酵液样品中含量较高的醇类为苯乙醇和3-甲基丁醇，分别呈现花香味和烧焦味、酒精味[19]。醇类物质种类与含量较高的为处理1、3、5。总体而言，第1天＋第2天接种（处理1、3、5）的样品醇类含量略高于第1天＋第3天接种（处理2、4、6）的组别。

如表6所示，6个发酵液样品中有2种醛类物质被检出，为壬醛和癸醛，分别赋予葡萄酒玫瑰、柑橘香和甜香、花香[21]，以处理5中含量略高（主要为壬醛），其他样品中含量均较低。

表5 酒样中醇类物质含量Table 5 Contents of alcohols in wine samples/(mg/L)

表6 酒样中醛类化合物含量Table 6 Contents of aldehydes in wine samples/(mg/L)

图1 各酒样的感官分析结果Figure 1 Results of sensory analysis

2.3 感官品评结果

各酒样的感官品评结果如图1所示。结合外观、香气和口感指标，综合评分由高到低依次是处理3、5、1、2、4、6。先接种速度发酵酵母S2、较风味发酵菌F6提前1 d的处理3所得酒样的果香和发酵香更加明显，香气和口感更加平衡，得分最高。综合而言，各样品间感官指标差异较小，采用第1天+第2天接种（处理1、3、5）的实验组感官表现略好于第1天+第3天接种（处理2、4、6）组别。

3 讨论与结论

本研究将速度发酵酵母与风味发酵酵母按照不同的顺序接种到‘蛇龙珠’葡萄汁中进行发酵，通过对发酵液理化指标、香气物质、感官指标的比较，探索混菌发酵中接种顺序对发酵酒质量的影响。结果表明，同时接种组和优先接种速度型发酵菌组发酵效率略高；优先接种速度型发酵菌组和优先接种风味型发酵菌组酯香物质含量较高。感官品评结果表明，采用第1天＋第2天接种的试验组感官表现略好于第1天＋第3天接种组别，处理3样品果香和发酵香明显，香气和口感协调，得分最高。综合分析认为，在混菌顺序发酵过程中，采用处理3的方法，即先接种速度发酵酵母S2、第2天再接种风味发酵菌F6，所得到的发酵酒质量最好。曾朝珍等[9]同样发现适宜的混菌发酵接种顺序可提高酯类、醇类物质含量，提高苹果白兰地的品质及风味；袁晓龙等[24]的鸭梨酒工艺实验也证实混菌发酵的接种顺序对发酵酒基础理化指标、感官指标有一定影响。因此，混菌发酵过程中接种顺序是影响发酵酒质量的重要因素之一，适当的接种顺序有助于获得高品质的发酵产品。

混菌发酵对提升葡萄酒质量、突出葡萄酒个性有重要意义。本试验采取的混菌发酵方式是以不同顺序接种两种酿酒酵母，探究较佳的发酵方式，接下来也可以在单因素实验的基础上，进一步探索接种顺序和接种比例优化的复合效果，探索最优的混菌发酵工艺。