微氧对‘赤霞珠’干红葡萄酒香气的影响

张军翔，张众

（1. 宁夏大学葡萄酒学院/葡萄与葡萄酒教育部工程研究中心/宁夏葡萄与葡萄酒工程技术中心，宁夏银川 750021；2. 宁夏大学生命科学学院，宁夏银川 750021）

香气是衡量葡萄酒品质和风格的重要指标之一，葡萄酒的香气特征是由酒中挥发性成分的种类、含量及其挥发能力所决定。尽管人们已经从葡萄酒中检测出上千种挥发性成分[1]，但是在葡萄酒风味研究领域，只有几十种主要的香气成分才是人们关注的重点[2]，而这些香气成分的组成和比例受葡萄品种、气候土壤、栽培方式、酿造工艺、陈酿环境等因素的影响，在不同葡萄酒中存在差异[3]。在陈酿过程中，葡萄酒香气成分含量会发生缓慢而持续的变化，伴随着香气的感官特征也发生变化，这种变化受一些陈酿工艺所调控，例如近些年来兴起的微氧（Micro-oxygenation, MOX）技术。

微氧工艺是指在人为可控的前提下，持续性或间歇性向葡萄酒中通入微量氧气以促进其成熟并提升其感官品质的技术。该技术于上世纪90年代初期由Patrick等在法国南部产区提出并应用于生产实践，于1996年经欧盟委员会批准得以合法使用[4]。微氧技术的发明，起初的目的是加快葡萄酒成熟并取代橡木桶的使用[5]，因为适量氧气能够促进酚类物质发生聚合反应，有效提升葡萄酒颜色的稳定性和口感的柔和度[6-9]，也能够改善葡萄酒的香气品质[10]。国外的研究表明，微氧处理有利于减弱葡萄酒还原味和生青味的气味类型[6,8,11]，增强果香味、香料味、坚果味、烟草味等香气特征，提升香气的复杂度[12-13]。

由于微氧技术在改善葡萄酒感官品质的同时，使葡萄酒的陈酿更加精确可控，有效缩短陈酿时间，并节约橡木桶的使用成本，因而得到行业的充分认可[14]。目前，该技术已经被广泛应用于世界多个葡萄酒产区[15-16]。尽管我国专家学者对微氧技术的研究相对较早[14,17]，但是相关研究主要侧重于探究微氧对葡萄酒的颜色、口感以及与之相关的酚类物质的影响[18-21]，而对葡萄酒香气调控的研究相对较少[22]。本研究以贺兰山东麓‘赤霞珠’干红葡萄酒为试验酒样，在陈酿期间对葡萄酒进行微氧处理，探究该技术对葡萄酒挥发性成分以及香气感官特征的影响，为微氧工艺在国内的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘赤霞珠’葡萄原料于2018年10月8日采收自宁夏大学葡萄酒学院葡萄园。葡萄含糖量为211.3±0.9 g/L，总酸为6.1±0.1 g/L，pH为3.49±0.01。

Vinozym vintage FCE果胶酶、Excellence XR活性干酵母、Oeno 1乳酸菌干粉、偏重亚硫酸钾，法国Lamothe-Abiet公司；次甲基蓝、酚酞、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、葡萄糖、邻苯二甲酸氢钾、氯化钠、氯化钾（均为分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；无水乙醇（≥99.8%，GC），上海阿拉丁试剂有限公司；4-甲基-2-戊醇（≥98.0%，GC），日本TCI公司；C8-C20正构烷烃（≥99.7%，GC），美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

TU-1901型分光光度计，北京普析仪器有限责任公司；雷磁PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；Enology Y15葡萄酒全自动分析仪，西班牙Biosystems公司；7890B型气相色谱仪、7000D型三重四级杆质谱仪、DB-WAX色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm），美国Agilent公司；DVB/CAR/PDMS萃取头（50/30 μm, 1 cm），美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒酿造

葡萄采收后立即进行分选、除梗、破碎，转入200 L不锈钢发酵罐，入料过程中均匀添加20 mg/L果胶酶和80 mg/L偏重亚硫酸钾，次日接种200 mg/L商业酿酒酵母启动发酵。发酵温度26～28 ℃，期间每天淋帽3次，每次10 min。发酵结束后继续浸渍3 d，将压榨汁与自流汁混合均匀。原酒主要理化指标如下：酒精度13.9±0.1 %vol，干浸出物30.2±0.2 g/L，游离SO210.5±0.9 mg/L，残糖1.50±0.03 g/L，可滴定酸6.1±0.0 g/L，pH 3.73±0.01。

接种10 mg/L的商业乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵。苹-乳发酵完成后添加120 mg/L偏重亚硫酸钾，密封并静置于酒窖中稳定3个月（温度16±2 ℃，湿度65±5%）。

1.3.2 微氧处理

在氮气保护下将稳定后的酒样分装于5 L加州瓶中，用食品级硅胶塞封口。设置1个对照组CK（密封，不通氧）和3个浓度水平的微氧处理，分别标记为M-0.5、M-1和M-2，对应的通氧量为每月0.5、1、2 mL/L。微氧处理方式借鉴Pechamat等[23]的方法，通过注射器将一定体积的纯氧注入瓶内。操作完成后，缓慢轻摇瓶身数次，保证氧气充分溶解，在氮气保护下拧紧螺旋盖，封口膜封口，通氧周期为每6天1次，每月5次。所有组均为3个重复，试验处理持续4个月。

1.3.3 理化指标分析

酒精度、干浸出物、还原糖、可滴定酸（g/L，以酒石酸计）、挥发酸（g/L，以乙酸计）依据GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；pH通过雷磁PHS-3C型pH计测定；总酚（g/L，以没食子酸计）、总花色苷、总硫、游硫通过Enology Y15葡萄酒全自动分析仪测定；总单宁通过盐酸示差法测定[24]；色度值取420、520、620 nm处吸光值之和，色调值取420 nm与520 nm处吸光值之比。

1.3.4 香气成分分析

使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（Head space-solid phase micro-extraction hyphenated with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS）技术对葡萄酒香气成分进行检测，检测方法以Hjelmeland等[25]的研究为基础并加以优化，具体如下：

称取1.5 g NaCl于20 mL顶空瓶中，加入5 mL酒样，再加入10 μL 4-甲基-2-戊醇（1.0083 g/L）作为内标，密封顶空瓶，置于CTC自动进样器；萃取头老化温度250 ℃，振摇器40 ℃预热5 min，振摇速度250 r/min，样品40 ℃萃取30 min；不分流模式进样，进样口240 ℃解吸10 min；载气高纯氦气（纯度≥99.999%），流速1 mL/min，起始柱温40 ℃，恒温5 min，以3 ℃/min升温到97 ℃，保持7 min，以2 ℃/min升温到120 ℃，再以3 ℃/min升温到150 ℃，最后以8 ℃/min升温到220 ℃，保持10 min；质谱接口温度230 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，溶剂延迟4.4 min。

以扫描模式定性（35～300 m/z），提取质谱图在NIST 17标准谱库中检索，并计算香气成分的保留指数[26]，与文献值对比；以SIM模式定量，每种香气成分选择3个特征离子，香气成分的浓度以香气成分的峰面积与内标峰面积的比值，再乘以内标的浓度来表示[27-28]。

1.3.5 香气感官分析

14名品尝员由宁夏大学葡萄酒学院SA感官品评小组成员以及宁夏大学葡萄与葡萄酒学研究生组成，每位品尝员均接受过系统的葡萄酒感官分析训练，并且对贺兰山东麓葡萄酒较为了解。香气感官分析采取盲品的形式，参考Tao等[29]的方法，对10类气味特征（生青味、果香味、果脯味、花香味、香辛料味、菌菇味、中药房味、坚果味、动物味、木质味）进行定量描述分析，气味特征感知强度的评分依据如下：0分，无此类香气；1分，微弱且较难分辨；2分，能分辨但较微弱；3分，容易分辨但不够强烈；4分，容易分辨且强烈。香气特征的修正频率（Modified frequency，MF）表示如下：

其中，F(%)表示某类气味特征的感知频率。为避免个体误差，本研究将F(%)＜20%的数据视为无效值（计为0%）；I(%)表示某类气味特征感知强度的平均值相对于总分的百分比。

1.3.6 数据处理及统计分析

数据平均值和标准偏差的计算、单因素方差分析、相关分析均通过R3.4.1软件来完成，绘图通过Origin 2018软件完成。

2 结果与分析

2.1 微氧对葡萄酒酿酒学参数的影响

酿酒学参数是了解葡萄酒基本品质的关键，微氧处理后葡萄酒的各项基本理化参数、酚类指标和颜色指标如表1所示。由表1可以看出，不同浓度的微氧处理对酒度、干浸出物、残糖、可滴定酸、pH值均无显著性影响，但是最高浓度的微氧处理（M-2）显著提升了酒样的挥发酸含量，可能会对葡萄酒品质产生一定的影响。SO2是葡萄酒生产和储藏过程中最为重要的外源抗氧化剂，游离态SO2具有很强的抗氧化性，通常以HSO3-形式存在于葡萄酒基质中，能够与H2O2和醌类物质等氧化剂或氧化中间产物发生反应，对其他成分具有一定的保护作用[30-31]。由表1可知，微氧处理浓度越高，总SO2和游离SO2的含量越低，其中最高浓度的微氧处理（M-2）导致了游离SO2含量过低，因此，在进行微氧处理的过程中要时刻监视SO2含量的变化，防止过度氧化。酚类物质是葡萄酒主要成分之一，决定了葡萄酒的颜色和口感。本研究发现，微氧处理后葡萄酒中总酚、总单宁、总花色苷含量以及色调值均表现出降低的趋势，而色度值则显著提升。

2.2 微氧对葡萄酒香气成分的影响

运用SIM模式对酒样中49种香气成分进行定量，包括脂肪醇、C6醇、芳香醇、甲酯、乙酯、异戊酯、乙酸酯、醛、酮、萜烯等类物质，各成分的保留指数和SIM定量离子详见表2。

由于香气成分种类繁多，依照Ortega-Heras等[32]的方法，对包含成分数目较多，且组内成分的化学结构和官能团特性具有相似性的组分（脂肪醇、乙酯、异戊酯、乙酸酯）按总量进行分析，对其他几组按各成分含量一一进行分析，结果见表3。

表1 微氧处理对葡萄酒酿酒学参数的影响Table 1 Effect of micro-oxygenation treatments on oenological parameters of wine

表2 香气成分的分类、保留指数、SIM定量离子Table 2 The classification, retention indices, and selected ion monitoring qualifying ions of aroma compounds

高级脂肪醇是葡萄酒中重要的风味物质，其浓度低于300 mg/L时能够增强葡萄酒香气的复杂度，但超过400 mg/L时则会给葡萄酒带来酒精味、辛辣味、杂醇油味等不良气味特征[32]。由表3可知，在陈酿期间对葡萄酒进行微氧处理，脂肪醇含量虽然有一定程度的增加，但是增加量均未达到显著性水平，而且含量仍然低于300 mg/L。

C6醇（己醇、叶醇）是葡萄酒中一类具有生青味特征的醇类物质。尽管微氧的作用之一是去除葡萄酒的生青味，但是本研究表明，不同浓度微氧处理对酒样中己醇和叶醇的含量均未产生显著性的影响。

芳香醇具有令人愉悦的香气特征，2-苯乙醇是葡萄酒中含量最高也是最为重要的芳香醇，酵母菌可以通过莽草酸途经和艾氏途径两条代谢途径合成2-苯乙醇[33]。由表3可知，不同浓度微氧处理后的酒样中2-苯乙醇的含量均有一定程度的提升，尽管在统计学上与对照组未达到显著性差异水平，但是增加量达到了12.73%～21.90%。苯甲醇也是葡萄酒中常见的芳香醇，但是与2-苯乙醇相比，苯甲醇的浓度较低，对葡萄酒香气的贡献程度也较小，微氧处理后其含量会有一定程度的降低。

酯类物质能够给葡萄酒带来果香味的香气特征。相关研究表明，微氧处理对酯类物质含量不会产生明显的影响[11,32]。本研究表明，陈酿期间适宜浓度的微氧处理（M-0.5、M-1）不会对酒样中乙酯、异戊酯、乙酸酯的含量产生显著性的影响，但是较高浓度的微氧处理（M-2）会显著降低以上各类酯的含量，可能会导致葡萄酒果香味的损失。

对于羰基化合物而言，不同浓度的微氧处理均显著提升了酒样中苯甲醛、双乙酰（2,3-丁二酮）和2,3-戊二酮的含量，而且通氧浓度越高，增加量越大。苯甲醛含量的提升，可能与苯甲醇的氧化相关。双乙酰与2,3-戊二酮具有相似的官能团和化学性质，二者均具有黄油和奶油的气味特征[34]。

里哪醇和香茅醇都是葡萄酒中较为常见的萜烯类物质，通常以结合态形式存在于葡萄浆果中，在发酵和陈酿过程中经酶促或非酶促反应被释放出来，具有花香味和柑橘味的香气特征[34-35]。由表3可以看出，陈酿期间适宜浓度的微氧处理（M-0.5、M-1）不会对酒样萜烯类物质的含量产生显著性影响，但是最高浓度的微氧处理（M-2）会显著降低香茅醇的含量。

苯乙烯含有乙烯基不饱和键，易发生氧化反应。本研究发现，所有浓度的微氧处理均能够显著降低酒样中苯乙烯的含量。由于苯乙烯具有汽油味等不愉悦的气味特征[34]，因此其含量的降低可能会对葡萄酒的香气品质产生比较好的影响。

从总的香气含量来看，陈酿期间适宜浓度的微氧处理（M-0.5、M-1）会一定程度上提升酒样香气成分的总体含量，而较高浓度的微氧处理（M-2）则有可能会降低香气成分总量，但是差异均未达到显著性水平。

2.3 微氧对葡萄酒香气感官特征的影响

2.3.1 香气感官特征的变化

经微氧处理后，葡萄酒香气成分的含量发生了变化，所以香气的感官特征也会受到一定的影响。本研究采用定量描述分析法对酒样的10类气味特征进行定量描述分析，以MF值为评价依据，结果如图1所示。

由图1可以看出，所有酒样的生青味、果香味、果脯味、花香味和香辛料味的MF值均较高，说明这几类气味特征是酒样较容易被感知的气味类型。M-0.5酒样生青味的MF值略低于CK，M-1、M-2酒样生青味的MF值均明显低于CK，说明微氧处理有利于减弱葡萄酒的生青味。所有微氧处理酒样的果香味也有所减弱，可能与酯类物质含量的降低具有一定的关系（表3）。微氧处理后酒样的果脯味均得到了加强，但是最高浓度微氧处理组酒样（M-2）果脯味的MF值远远高于CK和其他两组处理（M-0.5、M-1），但是果脯味过高可能会影响葡萄酒香气的协调性。与果脯味的变化情况类似，微氧处理后所有酒样的花香味均有一定程度的提升，能够增强葡萄酒香气的优雅度，其中每月1 mL/L的微氧处理（M-1）对花香味的提升作用最为明显。通过微氧处理，酒样的香辛料味有小幅度的减弱。

虽然其他几种气味类型的MF值相对较低，但是它们对葡萄酒香气的复杂度会起到一定的作用。由图1可知，不同浓度的微氧处理对葡萄酒菌菇味和中药房味的影响没有表现出一致性规律，但是对坚果味的香气特征均有较明显的增强，对动物味的气味类型均有不同程度的减弱（动物味并不一定能被所有消费者所接受）。由于本研究供试酒样始终未接触橡木制品，所以所有酒样均未感知出木质类气味，这也说明了本试验在探究微氧对葡萄酒香气的单因素作用时并未受到橡木香气的影响。

2.3.2 相关性分析

利用相关分析进一步探究微氧处理后葡萄酒香气感官特征的变化与香气成分变化之间的关系，结果见图2。由图2可知，生青味的变化与C6醇（己醇、叶醇）含量之间并无明显的相关关系，虽然生青味与酯类物质、乙偶姻和香茅醇具有较强的相关性，但是目前并没有研究表明这些物质能够给葡萄酒带来生青味[34]。果香味与乙酯、异戊酯和香茅醇均呈显著正相关，这是因为酯类物质能够给葡萄酒带来红色水果和黑色水果的香气特征，而萜烯类物质也具有热带水果的香气[34-35]。虽然微氧处理后酒样的果脯味有所增强，但是没有任何一种香气成分与果脯味的增强呈显著正相关关系，所以果脯味可能是葡萄酒中多种香气成分共同作用的结果[34]。花香味的增强与2-苯乙醇含量的增加具有显著正相关关系，这是由于2-苯乙醇具有玫瑰花和丁香花的香气特征[34,36]，而且由表3可知，2-苯乙醇在酒样中含量较高，受微氧的影响也较为明显。香辛料味的变化与苯甲醇、酯类物质、乙偶姻、萜烯类物质和苯乙烯含量的变化均具有较强的正相关关系，但均未达到显著性水平。菌菇味、中药房味以及动物味与各种香气成分均没有很好的相关性，这几类香气特征的主要呈香物质仍需进一步探究。此外，微氧处理后坚果味的增强与苯甲醛、双乙酰和2,3-戊二酮含量的增加均具有显著正相关关系。

图1 酒样香气特征的修正频率值Figure 1 The modified frequencies of aroma characteristics of wine samples

图2 香气特征和香气成分的相关矩阵Figure 2 The correlation matrix between aroma characteristics and aroma compounds

3 讨论与结论

在陈酿过程中，几乎所有葡萄酒的成熟都与氧相关，并通过氧化还原反应实现，氧气也是调控葡萄酒香气演化的最重要的因素之一[37-38]。微氧技术作为一种新兴的葡萄酒陈酿工艺，能够实现陈酿期间的精准供氧，对葡萄酒的成熟控制具有十分重要的意义。国内早期的研究探究了微氧对葡萄酒酚类物质、颜色以及口感的影响，在此基础上，本研究以贺兰山东麓‘赤霞珠’干红葡萄酒为试材，主要探究了微氧技术对葡萄酒香气成分和香气感官特征的影响。

试验结果表明，在陈酿期间对葡萄酒进行微氧处理，能够一定程度上提升高级脂肪醇的含量，但提升幅度较小，不会对葡萄酒香气品质产生不良的影响[32]。尽管C6醇具有生青味的气味特征，同时感官分析也表明，微氧处理后葡萄酒的生青味有所减弱，但是不同浓度水平的微氧处理均没有对C6醇含量产生明显的影响，而且本试验与前人的研究均未证实C6醇与生青味的变化具有较强的相关性，因此生青味的减弱可能与其他成分相关[4,12,32]。微氧处理后，葡萄酒的2-苯乙醇含量有较大幅度的提升，尽管在统计学上与对照组未达到显著性差异水平，但是从感官分析层面上能够推断2-苯乙醇含量的提升可能是导致葡萄酒花香味增强的原因之一。微氧处理后葡萄酒的酯类物质含量、香茅醇含量和果香味的MF值都有所降低，尤其是最高浓度微氧处理组酒样（M-2）的降低幅度最为明显，这表明在进行微氧处理时，通氧浓度一定要适宜。这是因为氧气会诱导葡萄酒产生自由基和醌类物质，前者会破坏酯类物质和萜烯类物质结构，后者会直接与它们发生反应[13,37]。微氧处理后葡萄酒中苯甲醛、双乙酰和2,3-戊二酮的含量均有显著性的提升，结合感官分析可知，这些成分含量的提升可能是导致葡萄酒坚果味香气特征增强的原因之一[34,39]。此外，感官分析还发现，微氧处理后葡萄酒的果脯味有所增强，香辛料味和动物味有所减弱，但是导致这些气味特征发生变化的主要呈香物质仍需进一步探究。

在评价葡萄酒香气变化之前，本研究也探究微氧处理对葡萄酒基本酿酒学参数的影响。结果表明，微氧处理并不会对葡萄酒酒度、干浸出物、残糖、可滴定酸、pH值等基本理化指标产生影响，与康文怀等[17-18]、王丽萍等[22]的研究结果相一致。但是较高浓度的微氧处理（M-2）会提升挥发酸的含量，而且也会过量消耗葡萄酒中的SO2，带来过度氧化的风险。同时，本试验也表明微氧处理导致葡萄酒酚类物质含量降低和色度值提升，结合前人的研究可以推断[4,5,8]，这是由于微氧促进了花色苷与单宁等物质的聚合反应，从而提升葡萄酒颜色的稳定性。