银杏双黄酮对高糖致微血管内皮细胞炎症反应的保护作用及机制研究

郭 丽，路青瑜，张启云，杨付梅，孙黔云

(1. 贵州医科大学省部共建药用植物与功效与利用国家重点实验室,2. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550014)

随着生活水平提高、生活方式改变及人口老龄化，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的发生率逐年上升，已成为威胁人类健康的重大疾病[1]。糖尿病相关的心血管并发症发病机制与微血管内皮功能紊乱和损伤密切相关[2-4]，高血糖是诱导糖尿病微血管内皮细胞炎症反应和功能损伤的重要病理因素[5-6]，目前对于糖尿病微血管并发症尚缺乏有效的治疗手段。我们前期筛选发现，银杏双黄酮对高糖(high glucose，HG)诱导的微血管内皮细胞炎症反应有保护作用。银杏双黄酮(Ginketin)是一种从银杏叶中提取出的黄酮类化合物，文献报道，银杏双黄酮具有抗炎、抗氧化、抗凝、神经保护活性等活性[7-8]。目前尚未见银杏双黄酮对高糖致微血管内皮细胞炎症反应的保护作用相关研究报道。因此，本研究基于前期的筛选发现，开展了银杏双黄酮对高糖致微血管内皮细胞炎症反应的保护作用及其相关的分子作用机制研究。

1 材料

1.1 试剂胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购于阿根廷Natocor-Industria Biológica公司(NTC-HK030)；DMEM低糖培养基购于美国Gibco公司(8119117)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司(0000351858)；质粒小提试剂盒(DR7123)、Lipo6000TM脂质体转染试剂(0526)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(090419191224)、ECL超敏显影液(P0018FS)均购自于江苏碧云天生物技术研究所；感受态细胞DH5α购自北京康为世纪生物科技有限公司(CW0808B)；NF-κB p65(8242S)、p-NF-κB p65(3033S)、Bax(5023S)、Bcl-2(4223S)、β-actin(4970S)均购自美国CST公司，银杏双黄酮标准品购自于成都普思生物科技有限公司(PS011016)；ICAM-1荧光标记抗体(FITC)购于美国BD公司(9197627)；细胞间粘附分子1(intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1)(9215121323)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)(13115125323)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)(2391577921)ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购于美国Sigma公司(SHBL0852)；D-葡萄糖(D-glucose)购自北京索莱宝公司(711B0913)，TNF-α蛋白购自北京义翘神州科技有限公司(LC120C1001)；其他试剂均为符合实验要求的分析纯试剂。

1.2 仪器NanoDrop 2000C超微量分光光度计(美国Thermo公司)；TS2-S-SM倒置相差显微镜、TS2-FL倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；NovoCyte 2040R流式细胞仪(美国ACEA公司)；连续波长酶标仪Gen5(美国Bio Tek公司)；ESCO CLM-170B-8-NF CO2培养箱(新加坡ESCO公司)；GloMax 96化学发光检测仪(美国Promega公司)；Fusion Fx Spectra化学发光成像分析系统(法国Vilber Lourmat公司)；Milli-Q Integral超纯水系统(美国Milipore公司)；电泳、转印系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 HMEC细胞培养HMEC由本课题组传代培养，采用DMEM低糖培养基(10% FBS)，于37 ℃、含5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。

2.2 MTT法检测细胞活力将HMEC以每孔1×104个接种于96孔细胞培养板，细胞培养24 h后，换用含不同糖浓度的DMEM培养基继续培养，每个组设置3个复孔，分别继续培养24、48 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，培养4 h后，每孔加50 μL的三联液充分溶解沉淀，孵育16 h后，在570 nm处检测每孔吸光度值A。

2.3 高糖对HMEC细胞粘附分子和炎症介质表达的影响将HMEC以每孔1×104个接种于96孔细胞培养板，培养24 h后，换无血清DMEM培养基，加入10 μL高糖(终浓度为35 mmol·L-1)处理，分别取0、6、12、24、48 h培养上清，按照ELISA试剂盒说明测定ICAM-1、IL-6和TNF-α的含量。

2.4 银杏双黄酮对高糖损伤HMEC细胞细胞粘附分子表达的影响

2.4.1ELISA检测细胞培养上清中ICAM-1的表达 将HMEC以每孔1×104个接种于96孔细胞培养板，培养24 h后，换无血清DMEM培养基，加入90 μL该培养基和10 μL用生理盐水稀释的银杏双黄酮(终浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7mol·L-1)预处理2 h，再加入10 μL高糖(终浓度为35 mmol·L-1)，待细胞继续生长48 h后，收集细胞培养上清，按照ELISA方法测定ICAM-1。

2.4.2流式细胞仪检测HMEC表面ICAM-1的表达 将HMEC以每孔2×104个接种到48孔细胞培养板，培养24 h后，换无血清DMEM培养基，实验分为五组，分别为对照组、高糖组(35 mmol·L-1葡萄糖)、银杏双黄酮组(1×10-5mol·L-1)、PDTC组(1×10-5mol·L-1)、TNF-α组(50 μg·L-1)。处理24 h后吸除上清培养液，用200 μL PBS洗涤细胞，然后加入50 μL的胰酶消化10 min，加入150 μL的无血清DMEM培养基终止消化，震荡5 min，将细胞转移至96孔V形板中，960 r·min-1离心5 min，弃掉上清液，加入200 μL的缓冲液A(含0.5% BSA和1 mmol·L-1MgCl2的PBS)洗涤细胞沉淀，离心5 min，吸净缓冲液A，加入20 μL的ICAM-1抗体，在室温震荡孵育1 h后，加入200 μL缓冲液A洗涤细胞，离心3 min后吸弃上清，加入200 μL缓冲液A重悬，流式细胞仪检测ICAM-1蛋白的表达情况，每次计数10 000个细胞，结果以平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)作图。

2.4.3免疫荧光观察银杏双黄酮对HG刺激HMEC表达ICAM-1的影响 将HMEC以每孔2×104个接种于48孔细胞培养板，培养24 h后，换无血清DMEM培养基，实验分为5个组：对照组、高糖组(35 mmol·L-1)、银杏双黄酮组(1×10-5mol·L-1)、PDTC组(1×10-5mol·L-1)、TNF-α组(50 μg·L-1)，继续培养24 h后，吸除培养液，用200 μL PBS洗涤细胞，然后加入ICAM-1抗体孵育1 h，再用洗涤液洗涤3次，最后一次洗涤后，吸干洗涤液，加入荧光淬灭剂后在荧光显微镜下观察并记录。

2.5 银杏双黄酮对高糖损伤HMEC细胞炎症介质表达的影响将HMEC以每孔1×104个接种于96孔细胞培养板，培养24 h后，换无血清DMEM培养基，加入90 μL该培养基和10 μL用生理盐水稀释的银杏双黄酮(终浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7mol·L-1)预处理2 h，再加入10 μL高糖(终浓度为35 mmol·L-1)，待细胞继续生长24 h后，收集细胞培养上清，按照ELISA方法测定TNF-α，48 h后测定IL-6。

2.6 NF-κB核转录活性检测

2.6.1质粒制备 参照碧云天质粒提取说明书进行，其浓度用NanoDrop测定。

2.6.2双荧光素报告基因检测 参照文献方法[9]，将HMEC以每孔1×104个接种于96孔黑板，培养24 h后弃上清，用无血清DMEM低糖培养基洗2次，然后加入DMEM低糖培养基90 μL，按转染试剂说明书进行转染。转染前先配制转染混合液，每孔加入10 μL，过夜后去除上清，各组同“2.4”进行相应组分处理，其中银杏双黄酮终浓度分别为1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol·L-1，加入高糖4 h后进行上机检测。按照下列公式分别计算Ra，为各组相对核转录活性，R1为萤火虫荧光素酶测定值，R2为海肾荧光素酶的测定值。

2.7 Western blot 检测细胞凋亡、NF-κB相关蛋白的表达本实验分4组，对照组、模型组和银杏双黄酮组(终浓度为1×10-5mol·L-1)、PDTC组(终浓度为1×10-5mol·L-1)。收集细胞，提取总蛋白并测定蛋白浓度，每组蛋白样品取10 μg上样，经12% SDS-PAGE电泳转膜后，恒温封闭15 min，加一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次洗涤时间10 min，加二抗孵育1 h，TBST洗膜后3次后，通过ECL显影，采用化学发光成像系统曝光。

2.8 统计学分析采用软件SPASS 18.0进行单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法。

3 结果

3.1 HG对HMEC细胞活力的影响以正常培养基(5.5 mmol·L-1)为对照，HMEC暴露于35、50 mmol·L-1葡萄糖处理24 h后，测定结果表明，细胞活力有一定的下降，高糖处理48 h后，35、50 mmol·L-1葡萄糖处理组细胞活力均有明显下降(P<0.01, Fig 1)。对两个组综合比较，后续实验均采用35 mmol·L-1葡萄糖来诱导内皮细胞炎症模型。

Fig 1 Inhibitory effect of high glucose on

3.2 HG对HMEC表达相关炎症反应分子的影响

3.2.1HG对HMEC表达ICAM-1的影响 HMEC暴露于HG，不同时间点细胞上清中的ICAM-1蛋白表达呈现上调趋势，其中，在6、48h与对照组相比差异具有显著性(P<0.05,P<0.01, Fig 2A)。

3.2.2HG对HMEC表达IL-6的影响 HMEC暴露于HG，随着时间的增加，细胞上清中的IL-6表达量都有一定程度的增加，其中，在48 h与对照组相比差异有显著性(P<0.01, Fig 2B)。

3.2.3HG对HMEC表达TNF-α的影响 HMEC暴露于HG，6、12、24、48 h细胞上清中的TNF-α表达量都有一定程度的增加，其中，12 h TNF-α有一定程度的上调，与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)，到24 h与对照组相比有明显上调(P<0.01, Fig 2C)，48 h组TNF-α表达量有一定程度降低。

Fig 2 The protein expression of ICAM-1, IL-6 and TNF-α after HMEC exposure to high

Fig 3 Effect of ginketin on protein expression of ICAM-1, IL-6 and TNF-α of HMEC induced by high

3.3 银杏双黄酮对高糖损伤HMEC细胞粘附分子和炎症介质表达表达的影响

3.3.1银杏双黄酮对HMEC表达ICAM-1的影响

3.3.1.1ELISA检测细胞培养上清中ICAM-1的表达 内皮细胞通过银杏双黄酮干预后，再用HG处理48 h，测定结果表明，3个浓度的银杏双黄酮均可降低ICAM-1的表达，并呈现一定的量效关系，其中1.0×10-5、1.0×10-6mol·L-1的银杏双黄酮有明显的抑制作用(P<0.01, Fig 3A)，PDTC阳性药物组与银杏双黄酮组相比差异没有显著性。

3.3.1.2流式细胞仪检测HMEC细胞表面ICAM-1表达 结果经统计分析后显示，与对照组相比，HMEC暴露于高糖后ICAM-1的表达有一定的上升，银杏双黄酮组和PDTC的荧光强度有一定的下降(Fig 4)。

Fig 4 Detection of ICAM-1 expression on surface of HMEC by flow

3.3.1.3免疫荧光观察HMEC表面ICAM-1的表达 荧光抗体孵育后，阳性模型TNF-α组HMEC绿色荧光强度较空白对照组明显增强；高糖组HMEC荧光强度与对照组相比略有上升，银杏双黄酮干预组和PDTC组荧光强度有一定的下降(Fig 5)。

3.3.2银杏双黄酮对HMEC表达IL-6的影响 内皮细胞通过银杏双黄酮干预后，再用HG处理48 h，测定结果表明，3个浓度的银杏双黄酮均可降低IL-6的表达，并呈现一定的量效关系，其中1.0×10-5、1.0×10-6mol·L-1的银杏双黄酮抑制效果差异具有显著性(P<0.01, Fig 3B)。

3.3.3银杏双黄酮对HMEC表达TNF-α的影响 HMEC经过银杏双黄酮干预后，再用HG处理24 h，测定结果表明，3个浓度的银杏双黄酮均可降低TNF-α的表达，并呈现一定的量效关系，其中1.0×10-5、1.0×10-6mol·L-1的银杏双黄酮抑制效果差异具有显著性(P<0.01，P<0.05, Fig 3C)，PDTC阳性药物组与银杏双黄酮组相比差异没有显著性。

3.4 银杏双黄酮对高糖损伤HMEC细胞致NF-κB转录活性的影响高糖刺激后，NF-κB的核转录活性明显上调，而不同浓度的银杏双黄酮对高糖所致的NF-κB核内转录活性的增强有干预作用，其中1.0×10-5、1.0×10-6mol·L-1的银杏双黄酮组与模型组相比具有统计学意义(P<0.05, Fig 6)，PDTC阳性药物组与银杏双黄酮组相比差异没有显著性。

Fig 5 ICAM-1 expression on HMEC cell surface detected by immunofluorescence(×100)

Fig 6 Effect of ginketin on transcriptional activity of NF-κB after HMEC exposure to high

3.5 银杏双黄酮对NF-κB、凋亡相关蛋白表达的影响

3.5.1银杏双黄酮对NF-κB p65蛋白表达及磷酸化的影响 Western blot实验结果表明，HG刺激24 h后，NF-κB p65总蛋白和p-NF-κB p65的表达水平均上调(P<0.01)，银杏双黄酮可以降低p-NF-κB p65蛋白的表达，这与模型组相比差异具有显著性(P<0.05)，其中，p65/p-p65的比值呈现明显上调(P<0.05)，与模型组相比，银杏双黄酮干预组可降低p65/p-p65的比值(Fig 7)。

3.5.2银杏双黄酮对凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot检测Bax、Bcl-2结果表明，与正常对照组相比，高糖模型中凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值有一定的升高，与模型组比较，银杏双黄酮干预后，Bax/Bcl-2的比值有下调趋势(Fig 8)。

4 讨论

糖尿病及其血管并发症是一种慢性炎症反应，且发病机制。微血管功能紊乱是糖尿病血管病变等病征的重要环节，微血管内皮的炎症反应是其功能紊乱和损伤的早期重要病理机制[10-11]。高血糖是诱发微血管内皮血管病变的重要病理因素，可导致内皮细胞过量表达黏附分子和炎症介质，进而招募血液循环中的单核细胞、白细胞和血小板粘附到细胞表面引起进一步炎症反应[12]。本研究表明，银杏双黄酮能有效抑制高糖诱导的HMEC炎症反应。

Fig 7 Effect of ginketin on expression of NF-κB p65 and

银杏药用历史悠久，最早见于《本草纲目》对银杏功效和利用的记载，其功效主要为祛痰、止咳、润肺、定喘等功效。银杏双黄酮是银杏提取物的主要活性成分，在银杏叶中含量较多，2015 版《中国药典》规定银杏叶提取物中银杏黄酮含量不得少于24%[13]。银杏双黄酮药用价值较高[13]。有文献报道银杏双黄酮可以抑制用佛波酯诱导的小鼠耳肿胀炎症反应，还可以通过抑制磷脂酶A2、环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶等促炎基因表达从而延缓慢性皮肤炎的进程[14-15]。

Fig 8 Effect of ginketin on expression

本研究首先构建了高糖诱导的微血管内皮细胞炎症反应模型。当HMEC暴露于高糖环境后，会引起NF-κB信号通路的活化，导致黏附分子(ICAM-1)和炎症介质(IL-6、TNF-α)的表达上调，凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值有上调趋势，细胞活力轻度下降，HMEC呈现出较为明显的炎症反应，银杏双黄酮可以有效干预高糖诱导的内皮细胞炎症反应表达上调。ICAM-1是介导中性粒细胞和内皮细胞黏附的分子，IL-6和TNF-α则是重要的炎症介质，这些黏附分子和炎症介质在炎症的发生、发展中扮演着重要的角色，其表达的上调是证明HG刺激HMEC发生炎症反应的直接证据。分别对高糖刺激后微血管内皮细胞培养上清和表面ICAM-1进行检测，通过荧光显微镜可以观察到细胞表面的荧光强度有一定增强，阳性对照TNF-α刺激组的荧光强度明显增强，这表明TNF-α作为一种强效炎症介质，可以明显刺激内皮细胞大量表达ICAM-1，能检测出细胞表面强烈的荧光信号，相比而言，高糖作为一种较为慢性的炎症反应刺激因子，呈现偏弱的荧光上调，流式细胞仪测定结果与免疫荧光观察结果高度吻合，这一结果与糖尿病微血管并发症是一种慢性炎症反应进程相符。NF-κB作为哺乳动物中的主要诱导转录因子，在固有免疫反应和慢性炎症反应中发挥着重要的作用。经过HG刺激HMEC后，NF-κB p65磷酸化、NF-κB转录活性明显上调，通过银杏双黄酮干预后，可使得NF-κB转录活性、磷酸化p65的表达下调，这表明银杏双黄酮可以干预高糖诱导的内皮细胞NF-κB信号通路的过度激活。在本研究中，当HMEC暴露于高糖后，凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达出现变化，其比值出现上调，提示呈现凋亡趋势。Bax与Bcl-2协同作用，分别促进或抑制细胞的凋亡[16]。当Bax的量高于Bcl-2时，促进细胞凋亡；反之，细胞凋亡被抑制。本研究提示银杏双黄酮可以干预HG引起HMEC的凋亡。

本研究表明了银杏双黄酮能有效抑制高糖诱导微血管内皮细胞早期炎症反应，其机制与银杏双黄酮抑制炎症相关通路活化从而降低炎症反应水平有关。

(致谢：本文实验工作于贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室药理与生物活性研究中心孙黔云研究员课题组完成，感谢实验室老师的指导和同事们的帮助。)