金匮肾气丸对去势大鼠骨微结构及ALP、OPG、IL-6的影响

张倩 杨旭 王媛 王世军 王花欣*

1.山东中医药大学，山东 济南 250355 2.山东省中医经典名方协同创新中心，山东 济南 250355

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一类以骨组织微结构破损、骨密度降低、易骨折为特征的代谢性疾病[1]。绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)在50岁以上的人群中发病率约为30 %[2]，引发的骨折及并发症严重影响着中老年人的身心健康，为家庭和社会带来巨大负担[3]，成为目前面临的重要公共卫生问题。

PMOP的发病主因是雌激素缺乏，因此临床常采用雌激素替代疗法，但长期使用会增加乳腺癌的发病风险[4]。中医治病求本，以“整体观念，辨证论治”为优势，注重机体的阴阳平衡，关注疾病的发生发展及变化。此外，中药资源丰富、药效理想、不良反应小等优势也为中医药治疗PMOP提供了广阔的市场[5]。金匮肾气丸由干地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮、附子、桂枝组成，具有温补肾阳，化气行水之功效，现临床主要用于治疗肾阳虚相关病症[6-7]。研究发现给予PMOP女性金匮肾气丸治疗可有效提高骨密度[8]，但具体机制未明。

本实验采用卵巢切除法(OVX)复制PMOP模型，观察金匮肾气丸对OVX大鼠体重、子宫形态、血脂血糖、钙磷、骨密度及骨微结构的改善情况，并检测金匮肾气丸对OVX大鼠血清ALP、IL-6及OPG的影响，以探讨其用于PMOP的疗效机制，为指导临床应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：9月龄SPF级SD大鼠40只，体重250～300 g，购自北京维通利华实验动物中心有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]。大鼠饲养于SPF级动物房，湿度46%左右，温度24 ℃左右。

1.1.2药物及试剂：金匮肾气丸由干地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮、附子、桂枝组成(药材购于山东中医药大学新中鲁医院，经山东中医药大学李峰教授鉴定为合格产品)；戊酸雌二醇片(补佳乐，1 mg/片，拜耳医药保健有限公司)；异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号217180501)；4 %多聚甲醛固定液(Biosharp，批号BL539 A)；ALP试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A059-2)；IL-6、OPG ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号E-EL-R0015c；E-EL-R0050c)。

1.1.3主要实验仪器：小动物气体麻醉机(美国Matrx公司)；高速冷冻离心机(中国赛默飞世尔科技有限公司)；全自动生化分析仪(桂林优利特电子集团有限公司)；酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；离活体一体化Micro-CT设备(NEMO，平生医疗科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1药物制备：据《金匮要略》原文记载肾气丸的药物用量为干地黄八两，薯蓣(山药)、山茱萸各四两，泽泻、茯苓、牡丹皮各三两，桂枝、附子各一两。方中各药物用量比例为8∶4∶4∶3∶3∶3∶1∶1，加适量水煎，取药液冷藏备用。

1.2.2分组与造模：按照随机数字表的方法将大鼠分为2组：假手术组8只，手术组32只。手术组采用OVX复制OP模型，假手术组只切除卵巢附近等量脂肪。术后3 d肌肉注射青霉素，防止感染。术后7 d，将手术组大鼠随机分为4组：模型组、金匮肾气丸高剂量组、低剂量组、雌二醇组，每组8只。

1.2.3给药方式及取材：将中药饮片水煎两次后，混合滤液并浓缩至0.85 g(生药)/mL(相当于临床等效剂量)为低剂量，浓缩至1.7 g(生药)/mL(相当于临床两倍用量)为高剂量。雌二醇片制成浓度为0.01 mg/mL(相当于临床等效剂量)的混悬液。灌胃量均为1 mL/100 g大鼠体重，连续给药3个月。10 %水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，取子宫及右侧股骨。

1.3 检测指标

大鼠去卵巢后每周称重，取材后称取子宫重量，计算子宫系数。取大鼠子宫置于4 %多聚甲醛中固定，石蜡包埋，组织切片，行HE染色，镜下观察子宫组织形态学改变。

将大鼠麻醉，取腹主动脉血，分离血清，全自动生化分析仪检测血清中血脂、血糖、钙、磷的含量，按照试剂盒操作步骤检测血清中ALP、IL-6、OPG的含量。

取大鼠股骨，利用Micro-CT进行扫描，测定股骨近端骨密度。利用BI-2000医学图像分析系统进行骨组织形态学计量分析，包括骨体积密度(BV/TV)、骨表面积和骨体积的比例(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)、结构模型参数(SMI)、CT均值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 金匮肾气丸对OVX大鼠子宫重量的影响

与假手术组相比，模型组体重增长量最高(P<0.01)，子宫系数最低，而各用药组有效的降低了由OVX导致的体重上升，子宫系数有所上升，见表1。

表1 金匮肾气丸对OVX大鼠体重及子宫重量的影响

2.2 金匮肾气丸对OVX大鼠子宫形态的影响

假手术组大鼠宫腔充盈，子宫完整，子宫内膜厚度适中，层次分明，子宫内膜上皮柱状细胞排列整齐，形态完整，腺体数量多。与假手术组相比，模型组大鼠子宫宫腔干瘪变形且内膜厚度明显变薄，上皮柱状细胞胞质减少，腺体萎缩减少，体积明显萎缩，血管稀少。与模型组相比，金匮肾气丸组与雌二醇组子宫较为完整，血管较为丰富，宫腔萎缩情况略有改善，腺体数量较模型组多，见图1、图2。

图1 金匮肾气丸对OVX大鼠子宫腔形态的影响(HE，50×)Fig.1 Effect of Jinkui Shenqi Pill on uterine cavity morphology of ovariectomized rats(HE，50×)

图2 金匮肾气丸对OVX大鼠子宫内膜及腺体的影响(HE，200×)Fig.2 Effect of Jinkui Shenqi Pill on uterus and gland in the ovariectomy rats(HE，200×)

2.3 金匮肾气丸对OVX大鼠骨密度及骨微结构的影响

用药3个月后，与假手术组相比，模型组骨密度明显下降(P<0.01)；与模型组相比，金匮肾气丸低剂量组骨密度明显上升(P<0.05)，见表2。股骨三维成像图可见，假手术组大鼠骨小梁大小、粗细适中、排列整齐、骨连接度好；模型组大鼠股骨骨小梁变短变薄、稀疏、断裂，明显呈骨质疏松状；给予金匮肾气丸治疗后，骨微结构明显改善，骨小梁结构完整，见图3、表3。

图3 金匮肾气丸对去卵巢大鼠骨密度的影响(三维成像图)Fig.3 Effect of Jinkui Shenqi pill on bone mineral density in the ovariectomy rats

表2 金匮肾气丸对OVX大鼠骨密度的影响

2.4 金匮肾气丸对OVX大鼠血脂和血糖的影响

大鼠去卵巢后，由于雌激素减少，导致体重上升，肥胖又进一步影响了血糖和血脂的正常值。与假手术组相比，模型组的血糖、TG、CHOL显著上升，相比于模型组，金匮肾气丸高、低剂量组大鼠血糖血脂明显下降，见表4。

表3 金匮肾气丸对OVX大鼠骨微结构的影响Table 3 Effect of Jinkui Shenqi Pill on bone microstructure in the ovariectomy

表4 金匮肾气丸对OVX大鼠血脂和血糖的影响

2.5 金匮肾气丸对OVX大鼠血清中钙、磷的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清中的钙、磷水平明显下降；而金匮肾气丸高剂量组较模型组的表达显著升高，见表5。

表5 金匮肾气丸对OVX大鼠血清中钙、磷的影响

2.6 金匮肾气丸对OVX大鼠血清中ALP、IL-6及OPG的影响

与假手术组相比，模型组大鼠血清中ALP、IL-6含量明显升高，OPG含量明显降低；与模型组相比，金匮肾气丸高、低剂量组与雌二醇组都有效的降低了血清中ALP、IL-6含量，提高了OPG含量，见表6。

表6 金匮肾气丸对OVX大鼠血清中ALP、IL-6及OPG的影响

3 讨论

中老年人多为阳虚体质，常出现腰膝酸软、怕冷、耳鸣、五更泄泻等症状。肾阳为全身阳气之根本，肾阳虚衰，骨骼得不到正常的气血充养，关节无法发挥其正常的屈伸、支持等功能，出现骨质疏松。金匮肾气丸出自《金匮要略》，被誉为“千古补肾阳第一方”。方中诸药合用，使肾阳振奋，气化复常，使肾阳得补，血脉畅通，筋脉、骨骼得养[9]。研究发现金匮肾气丸可缓解跟骨骨质增生带来的疼痛，有效治疗“骨痿”[10]。临床对100例OP患者在治疗基础上加服金匮肾气丸后发现观察组骨密度明显高于对照组[11]。现代药理学表明，山茱萸新苷Ⅰ具有促进成骨细胞增殖分化的作用，能显著升高成骨细胞Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG和NOX4的mRNA表达水平[12]。另实验表明，干地黄能显著抑制OVX对大鼠股骨和腰椎的影响[13]。

绝经后卵巢功能衰退，雌激素骤降引起体内脂肪代谢的紊乱，出现食欲亢进及活动减少，使基础代谢率降低，体内脂肪含量增加而导致肥胖[14]。脂肪细胞过度分化降低成骨细胞分化和骨形成，使骨形成小于骨吸收，从而引起骨矿物质含量减少，最终导致骨质疏松[15]。而钙、磷的变化是反映全身骨质代谢情况的重要指标[16]。实验表明，OVX大鼠体重明显上升，并且出现血糖及血脂的升高，钙磷水平下降，金匮肾气丸与雌二醇都有效地降低了由雌激素缺乏导致的肥胖及血糖血脂的异常，提高了血清钙磷水平。

ALP是一种存在于成骨细胞中的胞内酶，其活性与骨形成密切相关，因此ALP是反映骨形成的重要标志[17]。骨代谢旺盛时成骨细胞活跃，血清中ALP活性增强，OVX大鼠雌激素分泌减少，使骨呈现高代谢状态，即高骨形成和高骨吸收，同时骨形成小于骨吸收，造成大量骨质的丢失，这和绝经妇女的骨代谢情况相符合[18]。OPG由成骨细胞和血管内皮细胞分泌，能抑制破骨细胞前体细的分化和成熟，因此，血清OPG水平在骨质疏松早期诊断中有重要意义[19]，IL-6作为免疫系统的重要细胞因子，可直接激活破骨细胞活性，导致骨吸收活动增强，促进了骨质疏松的发生与发展[20]。雌激素作为主要抑制破骨细胞活性的激素之一，OVX大鼠体内雌激素含量下降，则破骨细胞活性增强，血清中IL-6水平提高[21]。

综上，本实验结果显示，金匮肾气丸通过影响ALP、IL-6及OPG的表达抑制破骨细胞活性，促进骨形成，改善骨组织微结构，提高骨密度，以改善骨质疏松，具有良好的临床推广价值。金匮肾气丸作为中药复方制剂兼具温补肾阳的作用，但后续还需进一步深入研究探讨其调控机制，为金匮肾气丸的临床应用提供实验基础。