吡咯喹啉醌通过降低氧化应激和RANKL/OPG比率减少去卵巢大鼠骨量流失研究

郑鹏骥 陆杨 张象 胡侦明

重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016

绝经后骨质疏松症是最常见的原发性骨质疏松症，其特征是骨质疏松相关脆性骨折的发病率显著增加[1]。尽管雌激素缺乏是骨质疏松症的主要原因，但由于心血管事件和乳房及子宫癌的风险增加限制通过补充雌激素用来治疗或预防这类疾病[2]。甲状旁腺素(PTH)是美国食品和药物管理局(FDA)批准的唯一临床试剂，可用于促进骨形成，但是使用期限不能超过2年[2]。目前的骨质疏松症治疗主要是抗骨吸收剂，但可能出现严重的不良反应，如骨形成的减弱[3]。因此，有必要寻求具有可长期用于治疗绝经后骨质疏松症的药物。越来越多的研究表明，活性氧(ROS)诱导的氧化应激随着衰老而增加，这与绝经后骨质疏松症的病理生理学有关[4-5]。过量的ROS可以抑制成骨细胞的分化和增殖、增强破骨细胞的分化，最终导致更多的骨吸收[6]。吡咯喹啉醌(PQQ)是一种氧化还原循环平面邻醌，最初被鉴定为甲醇脱氢酶的辅酶[7]。最近，PQQ由于其在自由基清除中的作用而受到越来越多的关注。然而，PQQ对雌激素缺乏引起的骨质疏松症的保护作用尚不清楚。本研究使用OVX大鼠模型评估了PQQ在抗雌激素缺乏诱导的骨质疏松症中的作用和潜在机制。

1 材料和方法

1.1 动物和研究设计

30只12周龄(225～260 g)雌性SD大鼠购自上海实验动物中心，适应性饲养1周后进行试验。所有实验期间大鼠均饲养在23 ℃恒温条件下12 h光暗循环的房间中，且所有大鼠都可以自由饮水和接受标准的啮齿动物饮食。大鼠随机分成3组(每组n=10)，即OVX组、OVX + PQQ组和Sham组；其中OVX组和OVX + PQQ组进行手术切除双侧卵巢，而Sham组进行假手术，具体手术方案参考已发表的文献[8]。除OVX+PQQ组外的所有大鼠均饲喂标准大鼠饮食。OVX + PQQ组大鼠在标准大鼠食物中加入4 mg/kg PQQ。药物治疗12周后，麻醉后通过颈脱位对所有大鼠进行安乐死，收集股骨和血液样本。

1.2 检测指标

骨密度和骨微观结构使用微型计算机断层扫描(Micro-CT)分析，取出右股骨并保存在10 %福尔马林液体中，随后进行Micro-CT平扫。使用随仪器提供的3D Creator软件(SkyScan)，对二维图像生成三维渲染。使用软件自动计算以下3D参数，包括骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、结构模型指数(SMI)。

随后对股骨进行生物力学检测，在CT测量后，对右股骨进行如前所述的3点弯曲试验。使用三点弯曲方法在大鼠安乐死后股骨离体标本进行评估机械骨强度。使用MTS 858 Mini Bionix框架进行测试。将每个股骨放置在两个钝边缘上，其边缘为22 mm。通过骨干中轴上的冲孔圆形凹口连续施加垂直载荷直至断裂。位移率设定为1 mm/min。测试后，计算机记录载荷-位移曲线，从载荷-变形曲线计算极限载荷(N)，能量(J)和刚度(N/mm)。

将股骨于液氮中冷冻并在RIPA缓冲液裂解，然后等份装载(20 mg蛋白质)，使用SDS-PAGE分离蛋白质。将蛋白质在100 V下转移至0.2 mm的聚偏二氟乙烯膜上60 min。使用以下一抗：OPG(1∶2 000，Cell Signalling)、RANKL(1∶750，Santa Cruz BT)、FOXO1(1∶500，Santa Cruz BT)和PPARγ(1∶500，Santa Cruz BT)，然后使用合适二抗处理。化学发光HRP底物检测抗原抗体复合物，并使用LI-COR C-Digit印迹扫描仪进行可视化，并使用相关的Image Studio 5.2软件进行光密度分析。

随后进行组织学检测，将股骨固定在福尔马林中并在升序乙醇系列中脱水。随后，将股骨嵌入甲基丙烯酸甲酯中并切成4 μm切片用于染色。切片用苏木精-伊红(HE)染色以评估微结构。用Osteomeasure软件(OsteoMetrics，Decatur，GA，USA)进行组织形态学分析。

1.3 生化分析

使用大鼠特异性试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)检测血清TRACP-5b、I型胶原C-末端交联端肽(CTX-I)、总抗氧化活性(T-AOC)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，检测根据制造商的说明书进行。

1.4 统计学处理

数据使用均数+标准差表示。采用单因素方差分析进行两组之间的比较。经方差分析后，Bonferroni检验确定两组之间比较差异是否有统计学意义 (P<0.05)。

2 结果

2.1 PQQ对OVX诱导的骨量丢失的影响

手术12周时大鼠的股骨Mciro-CT扫描结果如图1 A 所示，骨密度和股骨微观参数如表1中B～G所示，与Sham组相比， OVX组的股骨骨密度和骨微观参数显著降低(P<0.05)； OVX组的小梁间距显著增加(P<0.05)，而OVX + PQQ上述指标明显优于OVX组，差异有统计学意义(P<0.05)。骨组织形态计量学参数显示，PQQ对去卵巢大鼠股骨骨量和骨密度有保护作用。

图1 治疗12周大鼠股骨Micro-CT扫描结果注：与Sham组比较，*P <0.05，** P<0.01；与OVX组比较，#P< 0.05，##P<0.01。Fig.1 Micro-CT scans of femur in rats after 12 weeks treatment

2.2 组织学评估

治疗12周时，三组大鼠股骨干骺端HE切片如图2所示；去卵巢12周时，与Sham组相比较， OVX组的股骨干骺端骨小梁的量明显降低，骨小梁连接较为稀疏；经过12周PQQ干预，OVX + PQQ组大鼠股骨干骺端骨小梁数量明显增加，且骨小梁连接更为紧密。

图2 治疗 12周大鼠股骨HE切片结果注：A Sham组；B OVX组；C OVX + PQQ组；(10×)。Fig.2 HE tissue section of femur in rats after 12 weeks treatment

2.3 生物力学性能

生物力学测试获得的数据见图3，Sham组具有最高的极限载荷、能量和刚度；与OVX组比较，OVX + PQQ组极限载荷、能量和刚度明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 治疗对大鼠股骨生物力学的影响注：与Sham组比较，*P<0.05，** P<0.01；与OVX组比较，#P<0.05，##P<0.01。Fig.3 Effects of treatment on femur biomechanics

2.4 治疗后大鼠血清TRAP-5b、CTX-I、T-AOC、MDA和SOD的影响

与Sham组大鼠相比，OVX大鼠血清CTX-1、TRACP-5b和MDA水平均显著升高，而T-AOC和SOD活性显著降低，但这些参数通过补充PQQ得到改善(P<0.05)。

图4 治疗对大鼠生化指标的影响注：与Sham组比较，*P<0.05，** P< 0.01。与OVX组比较，#P<0.05， ##P<0.01。Fig.4 Effect of treatment on biochemical indicators in rats

2.5 WB结果分析

与Sham组大鼠相比，OVX大鼠RANKL和RANKL/OPG比率均显著升高，而OPG和FOXO1表达显著降低；经过PQQ干预后RANKL和RANKL/OPG比率均显著降低，而OPG和FOXO1表达显著增加(P<0.05)。

图5 PQQ对OVX大鼠RANKL、OPG、FOXO1、RANKL与OPG的影响注：与Sham组比较，*P<0.05。与OVX组比较，#P< 0.05。Fig.5 The effect of PQQ on RANKL, OPG and FOXO1 and the ratio of RANKL to OPG in OVX rats

3 讨论

OVX大鼠模型是绝经后骨质疏松症研究中成熟且广泛使用的动物模型[9]。在我们目前的研究中，我们使用大鼠模型来评估PQQ对雌激素缺乏诱导的骨质疏松症的影响。我们证实OVX导致雌激素缺乏诱导的大鼠骨质流失。同时，我们证明PQQ补充可以显著改善OVX诱导的骨质流失。虽然雌激素缺乏的主要结果是骨吸收增加，但雌激素在细胞水平上影响骨量[10]。本研究中进一步评估了OVX大鼠在补充PQQ后骨转换等参数的变化。目前的研究表明，OVX不仅可以诱导破骨细胞骨吸收，还可以减少成骨细胞的骨形成和骨强度。相反，通过补充PQQ，破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成和骨生物力学指标显著改善。我们的研究结果显示，PQQ在预防雌激素缺乏引起的骨质疏松症中起着显著的作用，它通过抑制破骨细胞骨吸收，刺激成骨细胞骨形成和增强骨强度。

本研究进一步探索补充PQQ来预防雌激素缺乏引起的骨质疏松症是否与OVX诱导的氧化应激减少有关。最近的研究强烈表明，雌激素缺乏会加速骨骼衰老，并显著损害抗氧化应激的防御机制[11]。最近的研究表明，雌激素缺乏会导致Bmi1的下调，从而增加T细胞中ROS，T细胞活化和RANKL的产生，破骨细胞生成和加速骨量丢失；进一步研究发现雌激素缺乏诱导的氧化应激，小鼠骨组织中抗氧化酶水平和活性降低，成骨和成骨细胞骨形成受损[12]。抗氧化剂使用导致OVX小鼠的成骨和成骨细胞骨形成的强烈改善[4]。目前的研究证实，雌激素缺乏可以诱导氧化应激，降低抗氧化酶水平和活性，而PQQ补充可以通过增加OVX小鼠的抗氧化酶水平和活性来减少氧化应激。

成骨细胞可以产生RANKL和OPG，以调节破骨细胞的形成和分化。由于OPG抑制破骨细胞生成，而RANKL支持破骨细胞的骨吸收，因此OPG/RANKL的比例是破骨细胞分化和随后骨吸收的关键因素。据报道，氧化应激对RANKL的反应增加，并作为破骨细胞生成的细胞内第二信使，通过RANKL-TRAF6-Rac1氧化酶依赖性途径介导破骨细胞增殖分化[6]。FOXOs的特征是存在一个称为叉头盒的有翼螺旋DNA结合结构域，代表了针对氧化损伤的关键细胞防御机制[5]。氧化应激促进FOXOs易位到细胞核内，翻译后修饰包括磷酸化，泛素化和乙酰化。雌激素缺乏通过OPG/RANKL信号传导途径诱导了骨形成的生化标志物显著下降以及破骨细胞生成的增强和FOXO1降低。在本研究中，PQQ显著下调了RANKL的蛋白质表达，增强成骨细胞中OPG 和FOXO1的水平。本研究结果表明，PQQ不仅可以有效地阻止雌激素缺乏引起的骨质疏松症，还可以通过防御氧化应激和改善RANKL/OPG比率。

综上所述，我们目前的研究表明，雌激素缺乏引起的骨量丢失不仅与增加的氧化应激和破骨细胞骨吸收有关，并且与成骨细胞骨形成减少有关。补充PQQ通过抑制氧化应激和改善RANKL/OPG比率，在预防由雌激素缺乏引起的骨质疏松症中起重要的作用。因此，目前的研究表明，PQQ有预防和治疗绝经后骨质疏松症的潜力。