异补骨脂素联合锌治疗对1型糖尿病大鼠骨量、骨密度及骨强度的影响

常培学 李海波 方其超 许振培 符茂雄

1. 海口市第四人民医院老年病科、内分泌科，海南 海口 571100 2. 海口市第四人民医院肾内科血透室，海南 海口 571100 3. 海南医学院附属第二人民医院内分泌科，海南 海口 570311

近年来，由于不合理的生活方式，饮食习惯和社会老龄化，糖尿病及其相关并发症的发病率迅速增加。据预测，到2045年全球糖尿病患病人数将增加到6.29亿[1]。糖尿病已成为另一个全球公共卫生问题。骨量流失是糖尿病的并发症之一，它是继发性骨质疏松症之一，其特征是钙磷代谢紊乱，BMD下降和骨微观结构变化[2]。锌作为一种必需的微量元素，在人体中起着重要的生理作用。锌也是胰岛素的一种成分，它调节胰岛细胞分泌胰岛素并稳定血糖，因此据报道锌对糖尿病大鼠有降血糖作用[3]。许多研究发现锌对去卵巢大鼠有骨保护作用[4]。值得注意的是，异补骨脂素是从多种水果，蔬菜和传统中药中分离得到的，对卵巢切除术引起的骨质疏松具有保护作用[5]。此外，异补骨脂素通过增加小梁骨微观结构的强度以及对骨形成的刺激作用[6]，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化[7]。然而，锌联合异补骨脂素是否有益于保护糖尿病患者骨量还没有报道。因此，在本研究中，我们通过注射链脲佐菌素建立1型糖尿病大鼠模型，并通过补锌和异补骨脂素来观察其对糖尿病大鼠骨量的保护作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 研究方案

50只12周龄体重为230～260雌性SD大鼠用于本研究中；所有大鼠适应性喂养7 d后，其中40只大鼠均腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)(剂量60 mg/kg)构建1型糖尿病模型。STZ在pH为4.5的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中溶解；剂量是基于先前报道的剂量[8]。对照组10只大鼠注射柠檬酸缓冲液。72 h后，用ACCU-CHEK Advantage血糖仪(Indianapolis Roche Medical Company，IN，USA)测量血糖以确认模型建立成功。随后将糖尿病大鼠分为以下4组，每组10只，分别为单纯对照组(Con)、锌治疗组(Zn)、异补骨脂素组(Bgz)以及锌联合异补骨脂素组(Zn+Bgz)；锌治疗组、异补骨脂素组以及锌联合异补骨脂素组大鼠分别给予0.25 mg/(kg.d)硫酸锌灌胃；20 mg/(kg.d)异补骨脂素灌胃给药或者两者联合给药治疗，连续12周。

1.2 标本获得及检测

为了评估药物治疗对大鼠骨量和骨密度的影响，使用Micro-CT在给药周期结束时对每只大鼠的右侧股骨进行扫描。使用Micro-CT扫描仪(SkyScan-1076 in IVIVE CT-scanner；SkyScan，Kontich，比利时)对股骨远端进行具有18 μm的各向同性扫描(每次扫描设置参数70 kV、85μA、180°)。使用Micro-CT自带的软件(V1.11.0.0；SkyScan)计算骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数目(Tb.N)和骨密度(BMD)。

随后进行组织学检测，用10%缓冲福尔马林固定大鼠右股骨24 h，然后用10%乙二胺四乙酸脱钙14 d。然后用乙醇和二甲苯对骨头进行脱水处理。石蜡包埋切片后，用苏木精和伊红(HE)染色制成4 μm薄的组织学切片。这些图像随后用光学显微镜获得。

随后进行三点弯曲试验以评估骨骼强度变化，使用商用力学测试系统(Bose Electrforce 3220，Bose Corp，Eden Prairie，MN)，通过三点弯曲试验检查左侧股骨，以评估整个骨骼的力学性能。股骨样本置于两个固定加载点之间跨度为20 mm的下部支架上。上加载板在骨干中点施加2 N的预紧力固定试件，然后以2 mm/min的恒定位移速率施加载荷直至破坏。同时绘制了荷载-位移曲线，并对数据进行了自动分析。根据三点弯曲载荷-位移曲线计算最大载荷、最大刚度和最大破坏能量。

后对股骨组织进行蛋白印迹检测，将右侧股骨组织中段在含有液氮的砂浆中用研磨器研磨成粉末状。用骨组织专用蛋白提取试剂盒(BestBio，中国上海)分离胫骨标本中的蛋白质。用10 %的三甘氨酸SDS-PAGE电泳40 g/样品，然后转移到PVDF膜(EMD微孔，Billerica，MA)。在含5%牛血清白蛋白的TBST(三缓冲液，0.5%吐温-20)中封闭1 h后，在含5%牛血清白蛋白的TBST中与抗 p-GSK-3β(ABCAM)、GSK-3β(ABCAM)、β-catenin (ABCAM)和β-actin的一抗孵育过夜，然后以1∶3 000稀释。使用ECL化学发光系统(GE ImageQuant 350，GE Healthcare)可视化蛋白条带，然后使用QuantityOne软件(Bio-Rad)进行分析。

1.3 统计学处理

使用SPS 19.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s test比较不同组间的数据。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠组织学变化

HE结清楚表明，Zn联合Bgz治疗能更好的保护1型糖尿病大鼠骨量的流失。如图1所示，与Con组相比，Zn、Bgz及Zn+Bgz组的大鼠骨小梁数量和密度得到明显的改善，而在Zn+Bgz组表现的最为明显。

图1 三组大鼠股骨干骺端HE切片检测结果注：A Con组，B Zn组，C Bgz组，D Zn+Bgz组 (20×)。Fig.1 Results of HE slices in the femoral metaphysis of three groups of rats

2.2 Micro-CT检测结果

Micro-CT更好的显示了骨小梁的总体改变情况，股骨的微观参数如图2所示。Zn组、Bgz组、Zn+Bgz组左侧股骨干骺端骨小梁BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th较Con组明显升高，而Tb.Sp较Con组明显降低 (P<0.05)；而Zn+Bgz组BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th较Zn组、Bgz组明显升高，而Tb.Sp较Zn组、Bgz组明显降低(P均<0.05)。

图2 四组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果注：a Con组，b Zn组，c Bgz组，d Zn+Bgz组；与Con组相比，*P<0.05；与Zn组相比，#P<0.05；与Bgz组相比，&P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of four groups of rats

2.3 骨强度改变比较

四组骨生物力学结果如图3所示，和Con组比较，Zn组、Bgz组和Zn+Bgz组左侧股骨最大负荷、刚度和最大功耗较Con组明显升高(P<0.05)；而Zn+Bgz组最大负荷、刚度和最大功耗较Zn组和Bgz组明显升高 (P均<0.05)。

图3 各组大鼠股骨最大负荷(A)、刚度(B)和最大功耗 (C)注：与Con组相比，*P<0.05；与Zn组相比，#P<0.05；与Bgz组相比，&P<0.05。Fig.3 Changes in the maximum femoral load(A), stiffness(B), and energy to failure (C)of rats in each group

2.4 Wnt/β-catenin信号通路改变

和Con组比较，Zn组、Bgz组和Zn+Bgz组的大鼠Wnt/β-catenin信号通路被激活；Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。和Zn组和Bgz组比较，Zn+Bgz组Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 使用WB检测Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin和β-actin的相对表达注：与Con组相比，*P<0.05；与Zn组相比，#P<0.05；与Bgz组相比，&P<0.05。Fig.4 Relative expression of Wnt 1、Wnt 5a，p-GSK-3β, GSK-3β, β-catenin to β-actin using Western blotting

3 讨论

糖尿病骨质疏松症(DOP)是糖尿病并发症之一。胰岛素的缺乏会导致钙和磷代谢紊乱，从而导致骨密度降低和骨微结构改变[9]。在高血糖环境中，糖尿病会影响骨骼代谢和骨骼完整性[10]，抑制成骨细胞分化，诱导成骨细胞凋亡，削弱骨形成并抑制骨矿化[11]，因此认为高血糖是诱发糖尿病性骨质减少的重要因素[12]。据报道锌对雌激素缺乏引起的骨质流失具有有益作用，据推测锌对绝经后骨质疏松症具有保护作用[13]。先前的体内和体外研究表明异补骨脂素具有骨保护作用。例如，向缺乏性激素的小鼠施用异补骨脂素(10和20 mg/kg，持续8周)后，骨质疏松症状得到改善，小鼠表现出增强的骨强度和改善的小梁骨微结构[14]。然而，尚未研究锌联合异补骨脂素是否较单独使用对糖尿病大鼠骨骼有益作用更为显著。在本研究中，结果表明锌联合异补骨脂素治疗12周可以预防糖尿病大鼠的骨质流失，且效果较单独使用更为显著。

在本研究中，在糖尿病大鼠中观察到BMD降低，以及骨骼结构破坏，在锌或者异补骨脂素干预12周后，这些症状明显改善，骨密度明显升高，证实锌或者异补骨脂素对糖尿病大鼠骨密度降低具有保护作用，而锌联合异补骨脂素治疗组骨密度改变最为显著。除了骨密度，骨保护的另一个重要评估指标是骨骼的形态参数，例如骨量和骨小梁厚度等[15]。本研究发现1型糖尿病大鼠股骨干骺端的小梁骨破裂，骨小梁变薄，骨小梁之间的间距变大。锌治疗组、异补骨脂素组以及联合治疗组大鼠BV/TV、Tb.Th和Tb.N均显著降低，而Tb.Sp显著降低；锌或者异补骨脂素干预治疗后增加了骨小梁的数量以及之间连接明显优于T1DM组，且联合治疗组的微观参数最佳。本研究进一步观察干预方法对骨强改变，结果显示Zn+Bgz组最大负荷、刚度和最大功耗明显优于其他组，这表明锌联合异补骨脂素可以显著保护T1DM大鼠的骨量和骨强度。

本研究进一步观察治疗对典型的Wnt配体(Wnt1)的表达影响，由于该配体激活Wnt/β-catenin途径来调节成骨细胞和骨细胞的活性[16-17]。 此外，已知非经典的Wnt配体(Wnt5a)可以激活非β-caten依赖性途径，并参与调节骨细胞活性[18]。我们的发现表明，单一的Zn或Bgz明显上调了大鼠Wnt1的骨骼基因表达。但是，发现Zn、Bgz或Zn+Bgz刺激对Wnt5a表达产生影响，揭示了非经典Wnt信号传导的潜在激活。此外，我们还揭示了在Zn+Bgz刺激下大鼠中β-catenin和p-GSK-3β/GSK-3β的蛋白表达水平更高，这为经典Wnt信号的激活提供了进一步的证据。总的来说本研究结果表明，Zn+Bgz刺激骨合成代谢可能与经典和非经典Wnt信号激活均有关。

综上，锌及异补骨脂素对1型糖尿病引起的骨量流失均有改善作用，而两者联合使用时效果更佳。其保护机制与GSK-3β/β-catenin信号通路上调有关。由于研究样本数和模型及研究时间的限制，后期会进一步研究本组合治疗的优势。