慢性阻塞性肺病患者血清长链非编码RNA GM15621 表达及意义

柯乐斌 钱小英 周垂杨 高仁贤

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种慢性呼吸系统疾病，其特征是气道阻塞的不完全可逆性，具有很高的死亡率和致残率。COPD 发病机制尚未完全清楚。研究发现，多种炎症细胞的相互作用可以诱发气道重塑和肺气肿，进而导致COPD 的形成[1]。长链非编码RNA（LncRNA）是一类RNA 转录物，参与调节各种细胞生物学过程。研究指出，多种LncRNA 与炎症反应密切相关[2]。有学者发现，LncRNA GM15621在炎性细胞中的表达显着降低，表明LncRNA GM15621的表达与炎症反应相关[3-4]。本研究旨探讨LncRNA GM15621 在COPD 病程的抗炎作用及其机制。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2014 年1 月—2019 年12 月在浙江省温州市人民医院呼吸科诊治的COPD 患者198 例为COPD 组，选择同期健康体检者140 名为健康对照组。本研究经医院伦理委员会审核通过，并符合《赫尔辛基宣言》，纳入本研究之前，所有患者均已签署书面知情同意书。

1.2 诊断标准 符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013 年修订版）》中COPD 相关诊断标准[5]，并将COPD 患者分为Ⅰ期和Ⅱ期，其中COPD Ⅰ期患者97 例，COPD Ⅱ期患者101 例。

1.3 纳入及排除标准 纳入标准：（1）COPD 病情严重为程度轻度～中度（对应临床分期Ⅰ期和Ⅱ期）；（2）年龄55～75 岁。排除标准：（1）合并糖尿病、高血压或高血脂患者；（2）患有恶性肿瘤的患者；（3）严重肺部疾病患者；（4）正在服用抗炎药物的患者。

2 方 法

2.1 血清炎症因子检测 取健康志愿者或COPD 患者静脉血3mL，添加入5μL 抗凝剂（擎科生物技术公司，中国）置于EP 管中，4℃下，1000r 离心5min，弃去沉淀，取上清，使用ELISA 试剂盒（百奥莱博，中国），采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，并通过RT-6100 酶标仪（CST，美国）检测TNF-α（肿瘤坏死因子α，批号170219），IL-10（白介素-10，批号170928），IL-12（白介素-12，批号180326）以及IL-1β（白介素-1β，批号170518）水平。

2.2 细胞培养与处理 痰液炎症细胞获取：使用高渗盐水通过超声雾化渗入诱导患者和健康志愿者咳液，将痰液置入培养皿中，使用无菌的医用镊夹选取黏稠度较大的痰液，与0.1%二硫苏糖醇（1：10，批号3483-12-3）摇匀，温水浸泡后使用筛网过滤杂质，用细胞沉渣涂片计数炎症细胞后用添加10%胎牛血清的DMEM 培养基（CST，美国，批号VS502T）进行细胞培养。选取对数生长期的炎症细胞胰酶消化后，用DMEM 培养基（批号130071）调整细胞密度为1×104个/mL，将细胞接种到96 孔板，室温孵育24h，按照说明书分别使用Lipofectamine TM 2000 将miRNA-15621 mimics 或miRNA-NC（CST，美国）转染COPD患者来源的炎症细胞，分为miRNA-15621 mimics组和miR-NC 组，检测转染效率。

2.3 蛋白免疫印迹 将COPD 患者来源细胞分为对照组细胞、miR-NC 组、miRNA-15621 mimics 组以及PI3K 抑制剂组（PI3KI）。对照组细胞添加DMSO 进行处理，miR-NC 组细胞添加转染对照物miR-NC，PI3KI 组细胞添加不同浓度的PI3K 抑制剂BEZ-235（碧云天试剂公司，中国，批号915019-65-7）进行处理，miRNA-15621 mimics 组添加不同浓度的miRNA-15621 mimics 进行处理，处理24h 后，胰酶消化收集细胞；使用双辛可宁酸（BCA）蛋白质检测试剂盒（Applygen Technologies，中国，批号at-47247）确定对照组，miR-NC 组细胞，miRNA-15621 mimics组，PIKI 组以及健康对照组来源细胞的蛋白质含量。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质，然后转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜与p-Akt 一抗（1：1000；Cell Signaling Technology，美国，cst-4007） 和甘油醛-3 脱氢酶（GAPDH，1：500；Santa CruzBiotechnology，美国，批号sc-20177）4°C 孵育过夜，TBST 洗涤三次后加入辣根过氧化物酶标记的小鼠二抗（1：500；Cell Signaling Technology，美国，批号sct-20977）室温孵育1h，TBST 洗涤三次后添加CEL显影蛋白（擎科生物技术公司，中国），并使用化学发光检测系统（Thermo Fisher Scientifc，美国）检测免疫反应蛋白。

2.4 RNA 分离和qRT-PCR 分析 根据制造商的说明，使用Trizol 试剂（百奥莱博，中国，批号28870）从COPD 患者来源细胞和健康志愿者来源的炎症细胞中分离总RNA。通过紫外分光光度法检测RNA 浓度和纯度，使用PrimeScript RT Master Mix Kit 将2μg总RNA 逆转录为cDNA（Takara，日本），随后依据qPCR 说明书，使用Mx3000P 实时PCR 系统（安捷伦，美国）执行实时PCR。反应条件为：95℃预变性45s；90℃15s；60℃30s；70℃45s，共60 个循环，miR-15621 正向引物：5′-CCGTAAGTGGCGCACGGAAT-3′，反向引物：5′-GGCATTCACCGCGTGCCTTA-3′；U6 正向引物：5′-GATTTCTCCCTCATCGCTTACAG-3′，反向引物：5′-CTGCTTCATGATCGTTGTTGCTTG-3′，以U6 为内参，所用PCR 引物均由浙江格鲁斯特生物技术公司（中国）合成。

2.5 随 访 采用门诊及电话对COPD 患者进行肺康复治疗后随访，随访时间截至2019 年12 月。总生存期（OS）为患者接受肺康复治疗时间至患者死亡时间或末次随访时间，同时记录患者术后生存情况。

2.6 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（） 表示，两组间比较采用独立t 检验，多组间比较先进行单因素方差分析后进行LSD-t 检验，计数资料以[n（%）]表示，组间比较实施χ2检验，检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 COPD 患者与健康对照者一般资料比较 COPD组198 例中男122 例，女76 例，年龄58～75 岁，年龄＞65 岁者72 例，有吸烟史患者84 例；健康对照组140 名中男78 名，女62 名，年龄57～73 岁，年龄＞65岁者56 名，有吸烟史者50 名，两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 COPD 患者与健康对照组LncRNA GM15621定量比较 与健康对照组比较，COPD 组患者血清炎症细胞LncRNA GM15621 含量明显减少（0.73±0.06比1.27±0.10，P＜0.05）。

3.3 COPD 患者影响因素预后分析 多因素Cox 回归分析结果显示，COPD 患者临床分期以及LncRNA GM15621 与COPD 患者的总体生存期显著相关，表明LncRNA GM15621 表达可作为COPD 患者生存的独立预测因子，见表1。

表1 单变量回归分析模型中不同因素对COPD 患者总生存期的影响

3.4 COPD 患者血清LncRNA GM15621 表达量与总生存期相关性分析 以检测的198 例COPD 患者血清LncRNA GM15621 表达量中位数2.023 为界线，将198 例COPD 患者分为低表达组（n=57）和高表达组（n=141），统计分析LncRNA GM15621 表达量与COPD 患者总体生存期和无病生存期的关系，评价LncRNA GM15621 对COPD 患者预后的判断价值。结果发现，与LncRNA GM15621 低表达组比较，LncRNA GM15621 高表达组总体生存期和无病生存期（DFS）显著延长（P 均＜0.05），见表2-3。

表2 COPD 患者血清LncRNA GM15621 表达量与总生存期相关分析

表3 COPD 患者血清LncRNA GM15621 表达量与无病生存期相关分析

3.5 COPD 患者与健康对照组患者血清炎症因子定量比较 与健康对照组比较，COPD 患者血清炎症因子TNF-α，IL-1β 和IL-12 含量明显升高，抗炎因子IL-10 水平明显降低（P＜0.05）。见表4。

3.6 LncRNA GM15621 通过PI3K/Akt 发挥抗炎作用 与健康对照组比较，患者来源的对照组细胞中p-Akt 磷酸化明显增加，而添加miR-NC 对其表达无影响（见图1）；与miR-NC 对照组比较，添加miRNA 15621-mimics 处理后，p-Akt 表达明显减少，炎症因子的表达明显减少，抗炎因子IL-10 表达明显增加（见表5），使用PI3K 抑制剂BEZ-235 处理后，细胞p-Akt 表达显著降低（见图2）。表明LncRNA GM15621 部分通过PI3K/Akt 信号转导通路发挥其抗炎作用。

表4 健康对照组和COPD 组患者血清炎症相关因子水平比较（pg/mL，）

表4 健康对照组和COPD 组患者血清炎症相关因子水平比较（pg/mL，）

注：IL-1β 为白介素-1β；IL-12 为白介素-12；TNF-α 为肿瘤坏死因子α；IL-10 为白介素-10；COPD 为慢性阻塞性肺病；与健康对照组比较，aP＜0.05

表5 不同浓度miRNA 15621-mimics 处理后细胞内炎症相关因子表达水平（pg/mL，）

表5 不同浓度miRNA 15621-mimics 处理后细胞内炎症相关因子表达水平（pg/mL，）

注：IL-1β 为白介素-1β；IL-12 为白介素-12；TNF-α 为肿瘤坏死因子α；IL-10 为白介素-10；与miR-NC 组比较，aP＜0.05

图1 不同浓度miRNA15621 mimics 处理后p-Akt 表达

图2 不同浓度PIK3 抑制剂或LNCRNA GM15621 模拟物处理后p-Akt 表达

4 讨论

近年研究表明，包括LncRNA GM15621 在内的多种LncRNA 参与包括COPD 在内的多种人类炎症性疾病的发生。LncRNA GM15621 又被称为为primiR-15621，在哺乳动物组织或器官（如肝、肺和肾）中广泛表达[6]。MiR-15621 是特征最明确的miRNA之一，在活化的B 细胞和T 细胞以及巨噬细胞中高度表达，在多种生理和病理过程中起着关键作用。文献报道，糖皮质激素可以通过miR-15621 对LPS 诱导的巨噬细胞炎症反应发挥抗炎作用[7-8]。本研究结果发现，COPD 患者炎症细胞LncRNA GM15621 表达低于健康对照组，且与不良预后密切相关，表明LncRNA GM15621 参与COPD 的发展。本研究还发现，COPD 患者血清炎症因子TNF-α，IL-1β 和IL-12 含量明显升高，而LncRNA GM15621 上调可以抑制炎症因子表达，提高抗炎因子IL-10 水平。

PI3K/Akt 广泛存在于哺乳动物细胞内，是细胞内的主要信号通路之一，广泛参与包括多种生物学过程，通过激活PI3K/Akt 通路可促进炎性细胞因子的释放，参与COPD 的发病[9]。研究指出，脂多糖（LPS）诱导PI3Kp110/p85 异二聚体的核易位，从而调节LncRNA GM15621 的表达，表明LncRNA GM15621 可能是PI3K 的靶基因[10-11]。本研究结果显示，相对于健康对照组，COPD 患者来源的细胞磷酸化Akt 表达显著增高，炎症因子的表达明显增加，使用PI3K 抑制剂处理或使用LncRNA GM15621 诱导细胞过表达后，磷酸化Akt 表达明显减少，炎症因子表达显著降低，抗炎因子表达明显增加，提示LncRNA GM15621 可能通过PI3K/Akt 信号转导通路发挥其抗炎作用。

总之，本研究表明，COPD 患者炎症细胞LncRNA GM15621 表达显著降低，炎症因子含量明显升高，抗炎因子水平显著降低，此外，LncRNA 低表达与COPD 不良预后密切相关，过表达的LncRNA GM15621 可能通过PI3K/Akt 信号转导通路抑制炎症因子表达，提高抗炎因子水平，从而抑制炎症反应，延长患者无病生存期和总生存期。