卵泡抑素样蛋白1 在维持结肠癌细胞生长中的作用

骆锴冉

直肠癌作为消化道最常见癌症之一，是全球第四大癌症相关死亡原因，目前对于进展期结肠癌缺乏有效治疗措施[1-2]。卵泡抑素样蛋白1（follistatinlike protein 1，FSTL1）是一种细胞外分泌糖蛋白，在人体组织中广泛表达，在细胞生存、增殖、分化和迁移以及胚胎脏器成熟过程中起重要的调节作用[3-5]。实验研究表明，FSTL1 可促进肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞生长和生存[6]。本研究通过检测FSTL1 在结肠癌细胞的表达，评估FSTL1 在体内结肠癌细胞中的作用，现报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株 人结肠癌细胞株（HT29、HCT116、DLD1）及人正常结肠上皮细胞株HCEC-1CT 购于美国模式培养物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 实验动物 30 只3～7 周BALB/c 雌性小鼠，体质量（20±2）g，购自中科院上海实验中心（许可证号：SCXK2013-0016），裸小鼠放置在层流净化屏障系统内饲养。温度（23±1）℃，湿度50%～60%，光照时间12h 光/12h 暗，水和饲料无限制供应。

1.3 主要试剂 吉姆萨染液和二甲基亚砜（DMSO）来源于杭州四季青公司；DMEM 培养基来源于江苏麦莎公司；含EDTA 胰蛋白酶购自中国吉诺公司；靶向FSTL1 基因的干扰小RNA 序列设计及带有绿色荧光蛋白的慢病毒（LV-siRNA-FSTL1）、阴性对照慢病毒（LV-siRNA-NC）和慢病毒包装试剂盒（批号BW11002） 购自南京巴傲得生物科技有限公司；Lipofectamine TM 2000 脂质体2000（批号11668019）购于美国Invitrogen 公司；Matrix 胶（批号356234）购自美国BD 公司；BCA 蛋白水平检测试剂盒（批号23227）购于南京凯基生物公司；p-ERK1/2（批号5284）、p-JNK（批号4223）、p-Akt（批号2764）、IκB（批号9502）和β-actin（批号9665）抗体购自美国Cell Signaling 公司，Tunel 试剂盒（批号KTA2011）购自美国Abbkine 公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 运用DMEM 培养液对细胞进行培育，同时在DMEM 培养液中添加10%胎牛血清，细胞放置细胞培养箱环境中，使用含EDTA 胰蛋白酶消化，按照1：3 的比例进行传代。

2.2 细胞感染 将DLD1 细胞以每孔5×105个接种于6 孔板，置于孵箱培养12h，待细胞达到30%融合时将细胞分为空白对照组（BC）、阴性对照组（siRNA-NC）和siRNA-FSTL1 组。siRNA-FSTL1 组细胞感染LV-siRNA-FSTL1，siRNA-NC 组细胞感染siRNA-NC，按照Lipofectamine TM 2000 说明书进行感染，病毒液感染复数为5。病毒感染细胞16h 后去除原培养基，添加DMEM 完全培养基，在荧光显微镜下观察慢病毒感染细胞后的绿色荧光，待荧光率＞80%时收集细胞，流式细胞仪检测感染效率，进行下一步试验。

2.3 蛋白质印迹法 细胞在细胞裂解液的作用下提取蛋白，组织标本剔除杂质后匀浆，再经细胞裂解液作用后获取总蛋白，总蛋白经匀浆、离心和变性等操作后，使用凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上后通过脱脂奶粉进行封闭操作，整体实验环境为4℃，维持12h，通过一抗、二抗反应后，添加一定的化学发光液，完成显色、曝光等处理。

2.4 建立结肠癌裸鼠异种移植瘤模型 将30 只裸鼠按随机数字表法分为siRNA-FSTL1 组（接种稳定感染LV-siRNA-FSTL1 的DLD1 细胞）、siRNA-NC组（接种稳定感染LV-siRNA-NC 的DLD1 细胞）和BC 组（接种未感染的DLD1 细胞），每组10 只。在含Matrix 基质胶的DMEM 培养基中重悬DLD1 细胞，并将细胞悬液的密度调节至3×107/mL。将0.2mL 悬浮肿瘤细胞液皮下注射到裸小鼠的右下肢，接受注射2 周后，裸鼠异种移植瘤的体积可增至100mm3，在第4 周时终止体内实验，取出异种移植瘤组织称重并计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（siRNA-NC 组瘤重—siRNA-FSTL1 瘤重）/siRNA-NC 组瘤重×100%。

2.5 免疫组织化学法检测FSTL1 和Ki-67 表达 所有样品用5%甲醛固定过夜，用梯度乙醇脱水法将肿瘤组织进行脱水处理，石蜡包埋，切片厚度5μm。根据LSAB 染色法进行免疫组织化学染色，Ki-67 阳性表达少部分位于细胞质，大部分在细胞核中。FSTL1阳性表达大都在细胞质中，随机选择20 个视野并在低倍镜下拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 图像处理软件分析Ki-67 和FSTL1 在样本中的积分光密度（IOD）值，取平均值。

2.6 Tunel 法检测异种移植瘤细胞凋亡 用5%甲醛溶液将肿瘤组织予以固定，再经石蜡包埋和乙醇脱蜡处理，严格根据Tunel 染色试剂盒的说明书步骤和说明进行下一步操作，Tunel 阳性细胞表现为核固缩和棕褐色细胞核，在低倍镜下选择10 个视野，统计视野中Tunel 阳性细胞，取平均值。

2.7 统计学方法 应用SPSS 16.0 统计软件完成统计分析，实验数据以均数±标准差（） 描述，采用单因素方差分析Dunnett-t 法比较总体及总体中两样本均数之间差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 FSTL1 在结肠癌细胞表达 Western blot 结果显示，FSTL1 蛋白在三种人结肠癌细胞株（HT29、HCT116、DLD1）表达明显高于人正常结肠上皮细胞株HCEC-1CT 表达，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 Western blot 检测FSTL1 蛋白在人结肠癌细胞株（HT29、HCT116、DLD1）和人正常结肠上皮细胞株HCEC-1CT的表达

3.2 慢病毒感染效率 将LV-siRNA-FSTL1 或LV-siRNA-NC 感染至DLD1 细胞后，在荧光显微镜下可观察到siRNA-FSTL1 组和siRNA-NC 组细胞均有绿色荧光，慢病毒感染效率为97%（见图2）。利用Western blot 检测DLD1 细胞FSTL1 相对表达量，结果显示，siRNA-FSTL1 组、siRNA-NC 组和BC 组FSTL1 蛋白相对表达量分别为（0.12±0.03）、（0.97±0.19）和（1.05±0.18），组间比较差异有统计学意义（F=35.436，P 均＜0.01），干扰效率为88.42%，见图3。

图2 荧光显微镜观察慢病毒感染效率（×200）

图3 Western blot 检测DLD1 细胞FSTL1 表达量

3.3 沉默FSTL1 基因表达对结肠癌裸鼠异种移植瘤生长的影响 将三组肿瘤细胞分别接种裸鼠皮下2 周后即可在皮下触及肿瘤，成瘤率100%，在第4周实验结束时，实验动物均未出现死亡。处死裸鼠后，将皮下肿瘤仔细剥离并称重，三组裸鼠尸检结果（如图4 所示）。BC 组、siRNA-NC 组和siRNAFSTL1 组肿瘤平均质量分别为（1.15±0.26）g、（0.84±0.15）g 和（0.53±0.07）g，siRNA-FSTL1 组裸鼠异种移植瘤重量明显低于BC 组或siRNA-NC 组，差异有统计学意义（F=6.857，P=0.002），抑癌率53.91%。

图4 在实验结束时，观察各组裸鼠异种移植瘤生长

3.4 沉默FSTL1 基因表达对结肠癌裸鼠异种移植瘤组织Ki-67 和FSTL1 表达的影响 免疫组织化学法测定Ki-67 和FSTL1 在各组裸鼠异种移植瘤组织阳性表达量（见图5）。BC 组、siRNA-NC 组和siRNA-FSTL1 组肿瘤组织Ki-67 的IOD 值分别为（125.62±20.13）、（114.61±18.72） 和（22.53±3.92），siRNA-FSTL1 组裸鼠异种移植瘤Ki-67 表达明显低于BC 组和siRNA-NC 组，组间差异有统计学意义（F=62.517，P＜0.01）；BC 组、siRNA-NC 组和siRNAFSTL1 组肿瘤组织FSTL1 的IOD 值分别为（258.31±31.42）、（287.63±26.74）和（87.48±11.21），siRNAFSTL1 组裸鼠异种移植瘤FSTL1 表达明显低于BC组或siRNA-NC 组，组间差异有统计学意义（F=54.652，P＜0.01）。

3.5 沉默FSTL1 基因表达对结肠癌裸鼠异种移植瘤细胞凋亡的影响 通过Tunel 法测定三组裸鼠异种移植瘤细胞凋亡，BC 组、siRNA-NC 组和siRNAFSTL1 组细胞凋亡率分别为（3.51±0.32）%、（2.93±0.44）%和（16.82±2.33）%，组间差异有统计学意义（F=65.218，P＜0.01），见图5。

图5 免疫组织化学法测定各组裸鼠异种移植瘤组织Ki-67 和FSTL1 蛋白阳性表达，Tunel 法测定各组异种移植瘤细胞凋亡（×400）

3.6 沉默FSTL1 基因表达对结肠癌裸鼠异种移植瘤ERK1/2、JNK、Akt 和IκB 表达的影响 感染siRNA-FSTL1 后可显著抑制裸鼠异种移植瘤p-ERK1/2和p-Akt 表达，与siRNA-NC 组比较，FSTL1、Ki-67、p-ERK1/2 和p-Akt 相对表达量分别降低（58.42±

4.53）%、（61.61±6.82）%、（43.23±3.92）%和（47.52±5.14）%，差异均有统计学意义（P 均＜0.05）。siRNAFSTL1 对肿瘤细胞p-JNK 和IκB 表达无影响（P＞0.05），见图6。

图6 Western blot 检测感染FSTL1 siRNA 后对体内DLD1 细胞中p-ERK、p-JNK、p-Akt 和IκB 表达的影响

4 讨论

免疫细胞和基质细胞分泌的细胞因子对于维持结肠癌细胞生长和存活有重要的作用[7-8]。结肠癌细胞会以旁分泌/自分泌方式分泌额外的细胞因子进一步放大增殖和存活信号[9]。FSTL1 基因作为一个由308个氨基酸构成的蛋白质，广泛分布于除外周淋巴细胞以外的机体细胞中[3-5]。同时FSTL1 在胶质瘤细胞、前列腺癌和胃癌等多种实体瘤细胞表达上调，抑制FSTL1 表达可有效降低癌细胞的多种恶性生物学行为[10-12]，但其具体作用机制尚不明确。本研究发现，FSTL1 在正常结肠细胞表达强度较弱，但结肠癌细胞株FSTL1 蛋白的相对表达量较正常结肠细胞均明显升高，提示FSTL1 在结肠癌的发生发展阶段充当着促癌基因的角色。为此，我们通过siRNA 技术特异性沉默DLD1 细胞FSTL1 表达，建立稳定低表达FSTL1的细胞株，在体内实验中，注入裸鼠皮下组织建立结肠癌异种移植瘤裸鼠模型模拟人结肠癌生长环境，结果表明，siRNA-FSTL1 组裸鼠的肿瘤重量明显小于BC 组和siRNA-NC 组裸鼠，表明体内慢病毒载体干扰FSTL1 表达能够稳定地抑制结肠癌裸鼠异种移植瘤生长，进一步提示FSTL1 在结肠癌中扮演原癌基因的角色。综上所述，鉴于FSTL1 在结肠良恶性组织及细胞中的差异性表达，以及在体内实验中的抑瘤效应，证实FSTL1 与结肠癌的发生和发展联系密切。

恶性肿瘤细胞的主要特征是无限增殖和抵抗凋亡能力，而促进细胞增殖和/或抑制细胞凋亡在恶性肿瘤发生发展过程中起到至关重要的作用。研究表明，FSTL1 对肿瘤细胞具有明显促进增殖和抑制凋亡的作用，靶向干扰FSTL1 的表达可促进体外结肠癌细胞凋亡[13]；MiR-137 可靶向调节FSTL1 表达从而在维持乳腺癌细胞化疗耐药中发挥重要作用[14]。本研究中，靶向FSTL1 基因的小干扰RNA 对结肠癌裸鼠异种移植瘤生长有明显抑制作用。此外，siRNAFSTL1 还可有效促进体内结肠癌细胞凋亡，同时抑制Ki-67 表达，从而表明FSTL1 在结肠癌细胞生长和凋亡中发挥重要作用。

ERK 作为一种脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶，主要位于细胞浆中，在诸如生长因子、激素、细胞因子、高糖和缺氧等刺激后作用下发生磷酸化，磷酸化的ERK 可进入细胞核中，最终对肿瘤细胞迁移、分化和増殖等多种生理学功能发挥调控作用[15-16]。为阐明FSTL1 控制结肠癌细胞生长的作用通路，本研究检测改变FSTL1 表达后对体外DLD1 细胞信号通路因子表达的影响，结果表明，FSTL1 可对ERK1/2和Akt 通路发挥正向调控作用，而对JNK 和NF-κB无明显调控作用。最新研究表明，FSTL1 在炎症细胞中发挥作用正是通过活化ERK1/2 通路而实现[17]，本研究结果与既往研究相似，提示FSTL1 通过正向调节ERK1/2 和Akt 通路从而在结肠癌细胞增殖和凋亡过程中发挥促进作用。

总之，本研究结果表明，FSTL1 在结肠癌组织表达上调，FSTL1 与结肠癌生长和凋亡明显相关，其作用机制可能与ERK1/2 和Akt 通路相关，但还需进一步探讨FSTL1 促进结肠癌生长中的具体作用机制。