化瘀消癥软胶囊对子宫肌瘤大鼠的干预作用及其机制

郝星，翁艳洁，任武，白剑

(华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，武汉 430030)

子宫肌瘤又称为纤维肌瘤、子宫纤维瘤，是女性生殖器官中最为常见的一种良性肿瘤，主要是子宫平滑肌增生引起的[1-2]。目前，子宫肌瘤确切病因尚未明确，可能与正常肌层的体细胞突变、性激素及局部生长因子间的相互作用有关[3]。子宫肌瘤在祖国医学理论中属于“癥瘕”的范畴，病因以瘀血内阻为主[4]。化瘀消癥软胶囊主要成分为桂枝、芍药、牡丹皮等，具有活血化瘀、消癥散结的作用。已有研究显示，化瘀消癥软胶囊对大鼠子宫肌瘤有一定的防治作用，可改善子宫病理状况[5]，但并未阐明其具体作用机制。有研究报道显示，作为化瘀消癥软胶囊主要成分的桂枝和芍药具有抗血管生成的作用[6-7]。然而，新血管形成是肿瘤生长和转移的必备条件[8]。血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)均具有强烈的促血管生成作用，在肿瘤组织血管形成中扮演核心作用。而缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是肿瘤缺氧微环境的核心调控因子，可促进VEGF、bFGF等促血管因子的表达进而调控肿瘤血管形成[9]。化瘀消癥软胶囊是否通过调控相关促血管生成因子表达抑制血管形成来改善子宫肌瘤进程，目前鲜有报道。因此，本研究将观察化瘀消癥软胶囊对子宫肌瘤的干预作用及对VEGF、bFGF、HIF-1α等促血管生成相关蛋白表达的影响，探索其干预机制，为临床合理用药提供理论依据。

材料与方法

一、动物和材料

1.实验动物：SD雌性大鼠，6～8周龄，SPF级，体重180～220 g(北京维通利华)，实验动物许可证号SCXK(京)2019-0050。所有大鼠饲养于温度为(22±2)℃，相对湿度为50%～70%，12 h/12 h明暗交替的环境中，且给予充足的水和食物。动物实验获得华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准。

2.主要试剂：化瘀消癥软胶囊由合肥天众药物研究所提供，主要成分为桂枝、芍药、牡丹皮、乌贼骨、山碴、黄芩、白术等，每1 g颗粒相当于6 g生药材。米非司酮(国药准字：H20010633，10 mg/片)购自北京紫竹药业有限公司；雌二醇(E2)、孕酮(P)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等ELISA检测试剂盒均购自上海钰博生物科技有限公司；兔抗人bFGF多克隆抗体、兔抗人HIF-1α单克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体和兔抗人GAPDH单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

3.主要仪器：光学显微镜购自德国Bresser公司；酶标仪购自上海美谷分子仪器公司；全自动凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

二、方法

1.动物的分组、建模与干预：适应性喂养一周后，将60只雌性SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型对照组、化瘀消癥软胶囊低、中、高剂量组(简称低、中、高剂量组)和阳性对照米非司酮组(简称米非司酮组)，每组10只。采用雌激素负荷法构建子宫肌瘤大鼠模型，除空白组外，其余各组大鼠均给予肌肉注射苯甲酸雌二醇(100 μg/只)，3次/周连续注射16周；从第13周时，每只大鼠增加注射黄体酮(0.9 mg/只)，3次/周，连续注射4周。造模期间，空白组给予注射相同体积生理盐水。从建模第9周起，经大鼠子宫病理学显示腺体增生及肌纤维明显增生提示造模成功，开始灌胃给药。将化瘀消癥软胶囊中的药物颗粒按照不同组别中的剂量要求(低剂量组：1.0 g/kg；中剂量组：2.0 g/kg；高剂量组：4.0 g/kg)以大鼠体重所需的每日用量溶于3 ml蒸馏水中；米非司酮组所用剂量为1.25 mg/kg，制成混悬液3 ml；空白组和模型对照组均给予生理盐水3 ml。1次/d，连续灌胃给药8周。末次给药24 h后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，用于后续实验。

2.子宫的一般观察：取出大鼠子宫，用电子游标卡尺测量子宫两侧最粗处直径，取其均值作为子宫肿胀度；称量子宫重量，并计算子宫系数(子宫湿重/体重)。

3.HE染色：子宫浸于中性多聚甲醛溶液中固定过夜，石蜡包埋后制成组织切片，进行常规HE染色，光学显微镜下观察子宫组织形态学变化。

4.血清性激素含量的检测：采集大鼠腹主动脉血，参照ELISA试剂盒说明书，检测血清中E2、P、LH及FSH的含量。

5.Western Blot检测：取适量大鼠子宫组织，采用BCA蛋白浓度检测法(Thermo Scientific，美国)标定组织中的蛋白质浓度，对蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，待蛋白完全分离后，转移至PVDF膜(Millipore，美国)上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，将bFGF(1∶1 000稀释)、HIF-1α(1∶500)、VEGF(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)等抗体分别与山羊抗兔HRP酶标二抗(1∶10 000)进行蛋白免疫印迹杂交，超敏ECL发光显色，凝胶成像系统显影及拍照，利用Image J软件(National Institutes of Health，美国)进行灰度分析，以GADPH为内参，根据灰度数据分别计算bFGF、HIF-1α和VEGF蛋白的相对表达量。

三、统计学分析

结 果

一、各组大鼠子宫肿胀度、子宫重量及子宫系数的比较

与空白组相比，所有其他组的大鼠子宫肿胀度、子宫重量及子宫系数均显著增加(P<0.05)；与模型对照组比较，化瘀消癥软胶囊高剂量组和米非司酮组的子宫肿胀度、子宫重量及子宫系数均显著降低(P<0.05)，但化瘀消癥软胶囊高剂量组和米非司酮组各项参数比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组大鼠子宫肿胀度、子宫重量及子宫系数的比较(-±s)

二、各组大鼠子宫平滑肌组织形态学变化的比较

HE染色显示，空白组大鼠子宫平滑肌细胞排列整齐，外纵行肌与内纵行肌分界线清晰；模型对照组大鼠子宫平滑肌出现明显增生，平滑肌细胞排列紊乱，肌层明显增厚；化瘀消癥软胶囊处理后明显抑制了肌层的增厚，且化瘀消癥软胶囊高剂量组和米非司酮组作用效果显著(图1)。

A：空白组；B：模型对照组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组；F：米非司酮组图1 各组大鼠子宫平滑肌组织形态学变化的比较(HE染色 ×100)

三、各组大鼠血清性激素水平的比较

与空白组相比，其他各组大鼠血清中E2、P水平显著上升，LH、FSH水平显著下降(P<0.05)；与模型对照组相比，化瘀消癥软胶囊中剂量组P水平显著下降(P<0.05)，化瘀消癥软胶囊高剂量组和米非司酮组E2、P水平显著下降，而LH、FSH水平显著上升(P<0.05)，(表2)。

四、各组大鼠子宫组织中bFGF、HIF-1α、VEGF蛋白表达的比较

如图2所示，与空白组相比，其他组大鼠子宫组织中bFGF、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量显著增加(P<0.05)；与模型对照组相比，化瘀消癥软胶囊中剂量组大鼠子宫组织中HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，化瘀消癥软胶囊高剂量组和米非司酮组大鼠子宫组织中bFGF、HIF-1α和VEGF蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清性激素水平的比较(-±s)

A：空白组；B：模型对照组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组；F：米非司酮组； 与空白组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05图2 各组大鼠子宫组织中bFGF、HIF-1α、VEGF蛋白表达

讨 论

中医认为子宫肌瘤是机体正气不足，风邪、情志内伤、房室所伤、饮食不节等引起脏腑紊乱，气机阻滞、停聚下腹胞宫而成，其主要病因病机是瘀血内阻[10]，因此，子宫肌瘤的中医疗法以活血化瘀为主。化瘀消癥软胶囊由多种药物成分组成，桂枝、芍药、牡丹皮等药物有增强机体免疫力作用[11]，乌贼骨和山碴有抗凝血功能，全方多种中药如黄茂、白术有抗肿瘤、抗炎性反应等作用。化瘀消癥软胶囊具有活血祛瘀、温通经脉之效，可针对子宫肌瘤病机治疗。

子宫肌瘤是性激素依赖性肿瘤，大量研究显示，采用雌孕激素协同法诱导SD大鼠，成瘤率高、稳定且与人类子宫肌瘤的大体形态、病理组织学特点相似，更易于观察相关药物的防治作用[12]。本研究采用雌二醇和黄体酮协同诱导雌性SD大鼠，其子宫肿胀度、子宫重量及子宫系数明显大于正常大鼠，HE染色显示子宫平滑肌细胞排列紊乱，平滑肌增生明显，肌层增厚显著，病理改变与人子宫肌瘤相似，与文献报道相符[13]，提示成功建立子宫肌瘤动物模型。

在成功制备大鼠实验性子宫肌瘤模型的基础上，我们观察化瘀消癥软胶囊对病变大鼠各项子宫大体指标影响。结果显示，化瘀消癥软胶囊可显著降低大鼠子宫肿胀度、子宫重量及子宫系数，改善大鼠子宫病理现象，提示化瘀消癥软胶囊可能抑制子宫平滑肌增厚，从而起到治疗子宫肌瘤的作用。

子宫肌瘤的发生、发展与机体性激素分泌异常密切相关。过量的E2可刺激子宫平滑肌细胞生长，发展为子宫肌瘤[14]。P的高表达可促进和维持子宫肌瘤细胞上的雌激素受体含量，加快肌瘤病灶增大[15-16]。LH水平的上升能够刺激卵泡的生长发育，进而促进子宫肌瘤的发生发展[17]。FSH与E2具有协同作用，可促进成熟的卵泡分泌雌激素，还能促使子宫肌瘤持续生长[18]。本研究显示，其他所有组血清E2、P水平显著高于空白组，说明子宫肌瘤具有明显的雌 、孕激素依赖性；与模型对照组比较，化瘀消癥软胶囊高剂量组E2、P水平显著下降，而LH、FSH水平显著上升，说明化瘀消癥软胶囊的治疗作用与改善机体内分泌环境有关，可拮抗大鼠体内性激素紊乱，从而改善子宫肌瘤。

实体肿瘤微环境中最基本的特征是缺氧，缺氧状态下，组织会诱导血管生成，进行缺氧代谢，帮助细胞在缺氧环境中保持增殖力，HIF-1α在上述过程中有重要的调控作用[19]。bFGF和VEGF是肿瘤血管生成的重要因子，bFGF是促进子宫肌瘤生长的重要因子，广泛分布于血管平滑肌、血管内皮等高度血管化的组织，可以促进子宫平滑肌细胞的增生和新血管的合成[20-21]。VEGF是血管新生主要的调节因子，缺氧状态下，HIF-1α会激活VEGF的表达，从而开启血管新生，导致肿瘤组织中生成大量的新生血管，促进肿瘤的生长[22-23]。本研究发现，化瘀消癥软胶囊可下调bFGF、HIF-1α、VEGF的表达，抑制血管的生成，可能这便是化瘀消癥软胶囊缩瘤的作用机制之一。另外，本研究发现，化瘀消癥软胶囊干预后仅高剂量组有显著改善效果，低、中剂量与模型对照组相比无统计学差异，提示化瘀消癥软胶囊治疗子宫肌瘤可能存在一个有效剂量，后续研究将深入探讨。

综上所述，化瘀消癥软胶囊对子宫肌瘤有明显的抑制作用，可能通过恢复大鼠性激素水平、抑制血管生成，从而改善子宫病理变化。抑制血管生成信号通路的传导可能是化瘀消癥软胶囊抗肌瘤机理之一，但子宫肌瘤的发生过程十分复杂，故化瘀消癥软胶囊对抗子宫肌瘤的作用机制还有待进一步探究。