人类白细胞抗原-G和干扰素γ与复发性流产相关性的初步探讨

冯晓琴，曹莹丽，郭尧，徐瑞琴，王治平，李经纬

(山西省人民医院1.生殖医学中心；2.妇产科；3.科教处，太原 030012)

复发性流产(RPL)是指2次及2次以上连续性发生在24周内的胎儿丢失的妊娠现象[1-2]。流行病学调查研究显示，越来越多的育龄女性遭受RPL的困扰，并且在近年来这一现象呈现上升趋势[3]。RPL再发风险随流产次数的增加而上升，连续发生2次流产临床应予以重点评估，既往RPL是导致女性后续妊娠失败的独立危险因素，曾有3次及以上的RPL患者再次妊娠的流产风险接近40%[4]。因此，发掘复发性流产的具体病因显得尤为迫切和重要。然而，导致RPL的原因有很多，其中包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、免疫因素和男方因素等[5]。免疫因素导致的RPL的分子机制目前仍不清楚，但大部分趋向免疫耐受的平衡研究[6]。妊娠这一生理过程属于半同种异体移植，从胚胎的成功种植到最后分娩整个过程需要复杂的免疫机制调控[7]。人类白细胞抗原-G(HLA-G)是一类主要组织相容性复合体(MHC)，HLA-G参与调控移植排斥反应和逃避免疫应答，可能还参与母胎界面的免疫耐受[8]。干扰素γ(IFN-γ)是一种由T1淋巴细胞(Th1)分泌的多效性因子，在参与抗病毒和免疫调节等方面有重要作用，在妊娠早期阶段对血管重塑也有积极作用[9-10]。基于目前HLA-G和IFN-γ与RPL的相关性仍不清楚，虽然目前动物水平的实验研究较多，但并没有关于这两个因子在RPL患者与正常妊娠者之间差异比较的分析报道。本研究通过临床采集RPL患者和正常妊娠者的外周血和流产绒毛样本，多角度比较RPL患者和正常妊娠者外周血以及流产绒毛组织中HLA-G和IFN-γ的表达差异，探讨HLA-G和IFN-γ与RPL的相关性，为临床诊治RPL提供新的理论依据和诊疗思路。

资料与方法

一、研究对象

选取2016年4月至2019年7月至我院生殖医学中心和妇产科门诊诊治的70例流产患者为研究对象，根据流产发生的起因分组，分为RPL不孕症患者的RPL组(n=29)和正常终止妊娠的早孕女性的对照组(n=41)。

RPL组患者纳入标准：临床确诊为稽留流产的患者，超声证实为宫内孕，未见胚芽或有胚芽但未见心管搏动，流产次数2～3次者，夫妇双方染色体核型正常。排除标准：有家族遗传病史、遗传性易栓症(PTS)、抗磷脂综合征(APS)、内分泌疾病因素、解剖学畸形因素、宫内感染因素、男方不育因素以及环境因素(吸烟酗酒、药物使用史等)等导致的不孕。

对照组患者纳入标准：超声显示证实为宫内早孕，有胚芽及或原始心管搏动，既往无自然流产、死胎、畸胎等不良孕产史或有既往正常分娩健康婴儿史，既往无妊娠期高血压疾病、糖尿病及全身急、慢性疾病。排除标准：有家族遗传病史、夫妇双方或一方染色体核型异常、基础妇科和内分泌疾病因素、解剖学畸形因素、不良环境暴露因素。

二、试剂和仪器

1.主要试剂：Trizol(15596-026，Invitrogen，美国)、氯仿(南京化学试剂有限公司)、异丙醇(南京化学试剂有限公司)、0.1% 焦碳酸二乙酯(DEPC)水(KGDN4500，江苏凯基生物技术股份有限公司)、红细胞裂解液(R7757，Merck，德国)、cDNA第一链合成试剂盒(RR036B，TaKaRa，日本)、实时定量PCR试剂盒(One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit II，RR086B，TaKaRa，日本)、酶联免疫试剂盒(武汉默沙克生物)。

2.主要仪器：紫外光度仪(UV-2450，SHIMADZU，日本)、PCR仪(veriti 96 well thermal cycler，ABI，美国)、荧光定量PCR循环仪(step one plus real time-PCR system，ABI，美国)。

三、研究方法

1.酶联免疫法检测：抽取受试者空腹时的外周血5 ml于真空采血管中，静置30 min，297g低速离心10 min，提取上清，于-80℃低温保存待测。按照试剂盒的操作说明步骤进行。

2.外周血白细胞和流产绒毛组织总RNA提取：外周血白细胞总RNA的提取：将抗凝的外周血分别加入到1.5 ml EP管中，每管400 μl，加入预冷的红细胞裂解液，静置10 min，4℃离心弃上清，重复一次。将离心后白细胞沉淀加入100 μl红细胞裂解液，轻柔吹打均匀，然后将几管合为一管，4℃离心弃上清。加1 ml预冷的Trizol于EP管中，按照Trizol试剂步骤提取。流产绒毛总RNA的提取：将流产绒毛组织剪碎放入匀浆器中，加入1 ml预冷的Trizol，反复研磨至大部分样品溶于Trizol中，将样品倒入1.5 ml离心管，在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离，按照Trizol试剂提取进行。测定外周血和流产绒毛样品在260 nm和280 nm的吸收值确定浓度和纯度，OD260/280在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度可以用于后续试验。

3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测：上述提取的总RNA立即进行反转录或-70℃保存。cDNA第一链合成(20 μl体系)：总RNA(2 μg)2 μl，5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，加无核酸酶的双蒸水至总体积10 μl，132g离心20 s，先在37℃保温15 min，85℃保温5 s，再置于冰上5 min。上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。HLA-G、IFN-γ和内参GAPDH使用各自的引物(表1)进行扩增。扩增反应体系：稀释10倍的cDNA模板1 μl，2×Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)10 μl，引物MIX(上游引物序列F/下游引物序列R各为10 μmol/L)2 μl，加0.1% DEPC水至总体积20 μl。扩增循环条件：95℃预变性5 min；95℃变性15～50 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，共进行40个循环。

表1 qRT-PCR引物序列

四、观察指标：比较两组患者的一般资料，包括年龄、体质量指数(BMI)、孕周、基础FSH、LH、E2、HCG和孕酮；两组患者的血清HLA-G和IFN-γ水平；两组患者外周血白细胞和流产绒毛中HLA-G和IFN-γ的mRNA相对表达水平。

五、统计学分析

结 果

一、两组患者的一般资料比较

RPL患者的年龄范围为22～41岁，平均年龄(34.61±6.24)岁，孕周在12周内，平均孕周在(8.44±0.35)周；对照组患者的年龄范围在22～38岁，平均年龄(32.83±6.14)岁，孕周在12周内，平均孕周为(8.71±1.06)周；两组患者的年龄、孕周、BMI、基础FSH、LH和E2水平比较，均无显著性差异(P>0.05)；RPL组患者在胎停7～8周时血清HCG和孕酮水平显著低于对照组 (P<0.05)(表2)。

表2 两组患者的一般资料比较(-±s)

二、两组患者外周血中HLA-G和IFN-γ水平比较

酶联免疫法检测两组患者血清HLA-G和IFN-γ水平，发现RPL组的HLA-G水平显著低于对照组，而IFN-γ水平显著高于对照组(P<0.05) (表3)。

表3 两组患者血清中HLA-G和IFN-γ的水平比较(-±s)

qRT-PCR法进一步检测两组患者外周血白细胞中HLA-G和IFN-γ的相对表达水平，发现RPL组HLA-GmRNA表达水平显著低于对照组，而IFN-γmRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01)(图1)。

与对照组比较，*P<0.01图1 两组患者外周血白细胞中HLA-G mRNA和IFN-γ mRNA的相对表达水平

三、两组患者流产绒毛组织中HLA-G和IFN-γmRNA表达

qRT-PCR检测发现，RPL组流产绒毛组织中HLA-GmRNA的表达量显著低于对照组，而IFN-γmRNA的表达量显著高于对照组(P<0.01)(图2)。

与对照组比较，*P<0.01图2 两组患者流产绒毛组织中HLA-G mRNA和IFN-γ mRNA相对表达水平

讨 论

IFN-γ是由Th1类淋巴细胞分泌的多效性因子，可促使毒性T淋巴细胞(CD8T)的增殖和分化，可识别病毒抗原感染的细胞以及肿瘤细胞，对其进行杀伤作用[11]。近年来的研究表明，IFN-γ可能参与妊娠早期的血管重塑和蜕膜完整性的调控[12]。但是，过量表达的IFN-γ将破坏妊娠早期母体的免疫耐受，导致胎盘形成受阻及早产等病理妊娠发生[13]。

研究发现，正常妊娠小鼠体内的IFN-γ对子宫内膜血管的重塑有积极作用[14]。Yang等[15]的研究表明，正常孕鼠妊娠13～16 d时，IFN-γ高表达有利于子宫内膜蜕膜化，创造有利于胚胎种植的内膜环境。然而本研究发现，RPL患者血清IFN-γ水平反而是显著高于正常妊娠者(P<0.05)，提示IFN-γ因子在妊娠初期对于胚胎植入过程的影响并不完全是积极作用。Li等[16-17]研究表明，妊娠雌鼠体内IFN-γ过量表达将严重影响雌鼠子宫内膜容受性从而调控免疫细胞和趋化因子的异常表达最终导致小鼠妊娠失败。本研究在人体水平上进一步证实了RPL患者外周血和流产绒毛组织中IFN-γmRNA的相对表达量均显著高于正常妊娠女性(P<0.05)，提示妊娠早期IFN-γ因子表达异常增高可能不利于胚胎的稳定种植和妊娠维持，IFN-γ的异常波动与RPL的发生存在一定的相关性。结合本研究中的RPL女性胚胎停育大多发生在孕40～60 d左右，由此我们推测，IFN-γ在正常妊娠初期的表达可能是一个曲线走势，即怀孕开始阶段IFN-γ高表达，促进母胎界面血管重塑，帮助胚胎侵袭子宫内膜；随着胚胎的不断植入，在孕早期40～60 d时IFN-γ表达下调才能有效协助母体免疫自然杀伤细胞(NK)细胞蜕膜化，发挥保护胚胎的作用。本研究的RPL患者外周血和流产绒毛组织中IFN-γmRNA相对表达量均显著高于正常妊娠者，表明在此孕期阶段这些RPL患者体内的IFN-γ表达未能有效下调，因此引起母胎免疫系统耐受紊乱，对胚胎产生排斥作用而引发流产。因此，在妊娠初期，IFN-γ因子的水平可能是一个动态变化的状态，并且在孕初期的不同阶段需要维持在一个适度的范围内，表达过低不利于胚胎侵袭和血管重塑，表达过高可能会逆转母体免疫系统对胚胎的耐受作用，引发母体免疫系统对胎儿的排斥。妊娠早期RPL女性异常高表达的IFN-γ因子可能促使母体免疫调控向炎性方向发展，识别并排斥带有一半父本抗原的胚胎，不利于胚胎着床和胎盘形成从而导致流产。

HLA-G属MHC分子中的一类人类白细胞抗原-G亚型，最初是在器官移植的患者体内发现，参与免疫耐受和肿瘤逃逸[18]。HLA包括Ⅰb型和Ⅰa型这两类亚型，HLA-G属于Ⅰb类亚型，可促进绒毛着床和血管发育，在母体妊娠初期适量表达，可能参与稳定母胎免疫耐受。另一类亚型Ⅰa类包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，这几类亚型属于高度多态性MHC，主要激发对异体的排斥反应，妊娠初期需要母体的Ⅰa类HLA沉默[19]。Morandi等[20]分析表明，与Ⅰa类MHC亚型相比，HLA-G具有低多态性和严格的组织特异性，发现其主要存在于在母胎界面绒毛滋养层细胞、女性生殖道、卵泡液以及体外培养胚胎的培养液中，可能参与胚胎着床的免疫耐受。

Tilburgs等[21]研究发现，HLA-G和蜕膜自然杀伤细胞(dNK)之间存在短暂的微循环信号对话，参与调控母体dNK的稳定转化，为胚胎着床准备有利的内膜环境。最新研究表明，母胎界面HLA-G是连接绒毛滋养层细胞与dNK的关键桥梁分子，绒毛滋养层HLA-G的稳定表达能有效激活母体dNK特异性转录因子同源框(PBX1)的活化，从而诱导母体大量表达多效生长因子(PTN)和骨甘氨酸(OGN)，这些促生长因子的持续作用方可维持妊娠初期胎儿的稳定发育[22-23]。这些研究从动物层面上阐述了在胚胎植入初期，HLA-G参与母胎免疫耐受的重要性，妊娠初期上游母胎界面HLA-G的稳定表达，能有效保证下游生长因子的功能。李婷等[24]用酶联免疫法研究显示，RPL患者血清HLA-G水平低于无自然流产史的妊娠孕妇。本研究首先比较了两组患者血清HLA-G水平，发现RPL组患者血清HLA-G水平显著低于对照组(P<0.05)；然后进一步用qRT-PCR比较RPL患者和正常妊娠终止者外周血和流产绒毛组织中HLA-GmRNA的相对表达量，结果发现RPL组患者的外周血和流产绒毛中的HLA-GmRNA表达均显著低于妊娠正常维持的女性(P<0.01)。这一研究结果表明，HLA-G参与妊娠早期胚胎稳定的植入，低于妊娠维持正常水平的HLA-G与RPL的发生相关。妊娠初期，如果HLA-G表达下调，可能会影响胚胎侵入子宫蜕膜和重铸螺旋动脉，绒毛着床不充分，严重影响胎盘的形成。但是，Hviid[25]研究发现，妊娠初期如果HLA-G水平过高，滋养细胞侵蚀内膜力度就会增强，可能导致滋养层细胞肿瘤发生。因此，妊娠早期HLA-G水平也需维持在一个合适的范围之内，水平过低不利于胚胎的稳定植入和妊娠的维持，水平过高将逆转它的积极效应，对母体产生不利影响。

Yang等[15]的研究显示，妊娠早期IFN-γ高表达会促进MHC的表达，MHC表达上调后作用于NK，一方面使NK细胞的免疫杀伤作用失活，另一方面又能促进NK细胞分泌保护性因子白介素-2(IL-2)和白介素-4(IL-4)，从而保持了母胎免疫耐受和妊娠维持。可见，妊娠初期MHC和IFN-γ的表达之间存在一定关联。本研究中RPL患者的外周血和流产绒毛中IFN-γmRNA表达相较于正常妊娠者异常偏高，同时HLA-GmRNA表达量偏低。综合分析，RPL患者同时存在IFN-γ和HLA-G表达水平的失衡，我们推测RPL患者妊娠初期IFN-γ异常偏高与MHC表达也可能存在一定的关联，IFN-γ过表达可能下调HLA-G(Ⅰb类亚型MHC)表达，同时增强HLA-A、HLA-B和HLA-C(Ⅰa类亚型MHC)表达，HLA-G的下调和Ⅰa类亚型的上调活化母体辅助性T淋巴细胞(CD4T)反应，母体免疫系统识别一半父本抗原的胚胎而产生排斥反应。我们将后续扩大RPL组的样本量进行验证，深入研究IFN-γ过表达对HLA-G的调控以及对下游免疫因子的影响。

综上所述，妊娠早期在维持母胎免疫耐受平衡的过程中，HLA-G和IFN-γ因子起到关键性的调控作用，这两类因子均需维持在一个合适的水平范围内。适量的IFN-γ和HLA-G因子有利于胚胎滋养细胞侵袭内膜和妊娠的维持，在稳定母体界面的免疫耐受方面起积极作用；HLA-G和IFN-γ的表达失衡不利于胚胎种植和妊娠稳定，可能引起母体免疫系统对胎儿的识别和排斥反应从而引发流产。本研究结果可能为临床诊疗RPL患者提供有意义的理论依据和参考价值。