围绝经期抑郁大鼠肠道微生物菌群的研究

张巧利，王妍，贾婵维，刘艳君，李芬

(1.首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科，北京 100026；2.陕西省西安市第五医院检验科，西安 710082；3.西安交通大学第一附属医院妇产科，西安 710061)

围绝经期是女性从育龄期进入老年期必经的人生阶段，即女性从生殖功能旺盛的状态逐渐过渡到生殖功能衰竭的阶段。进入围绝经期的妇女随着卵巢排卵功能的减退，体内雌、孕激素水平最终下降，月经逐渐停止，可出现一系列躯体及精神心理症状。抑郁是一种精神障碍，患者社会功能下降，会产生极端的想法和行为。统计数据显示女性抑郁的发生率为25%，男性为12%[1]。围绝经期是妇女患抑郁症最高的时期[2]，我们前期研究提示有绝经相关症状的女性抑郁症的发生率更高[3-4]。与绝经前相比，围绝经期早期心理压力增加[5]，抑郁的发生率是绝经前的4倍[6]。据估计，到2030年，全世界将有12亿妇女进入更年期[7]，因此，对于围绝经期抑郁的研究显得尤为必要和迫切。

肠道是人体最大、最主要的免疫器官，研究发现肠道菌群失调与多种生理和精神疾病密切相关[8]，因此，肠道菌群与机体健康的相关研究已成为近年的焦点。肠道微生态可通过“微生物-脑-肠轴”作用于中枢系统，研究发现肠道菌群失调与抑郁关系密切，补充肠道益生菌、调节肠道菌群可以改善抑郁状态[9]。本研究以围绝经期抑郁大鼠为模型，研究其肠道菌群的变化，为围绝经期抑郁的治疗提供实验室依据。

材料与方法

一、实验动物与设备

1.实验动物：4月龄SD健康雌性未孕大鼠20只，体重(200±20)g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供(批号：XAJT2013-056)。SPF级动物实验室饲养，室温21℃～23℃，湿度50%～60%，昼夜明暗交替12 h：12 h，5只/笼。进入实验前适应性饲养1周，所有大鼠均常规饲料喂养，自由进食。动物实验获得西安交通大学医学院伦理委员会批准。

2.试剂：粪便基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技)；DNA Marker和PCR试剂盒(大连宝生物工程)；蔗糖、戊巴比妥钠(天津化学试剂三厂)；碘伏、丙烯酰胺(上海联迈生物工程)；甲叉双丙烯酰胺、尿素、去离子甲酰胺、琼脂糖和溴化乙啶(上海钦诚生物科技)。

3.仪器：旷场实验仪器(TSE Systems，德国)；C1000 TouchTM、Thermal Cycler PCR 仪、DCodeTM变性凝胶电泳仪和Gel DocTM2000 凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)；InGenius3 Gel Documentation System凝胶成像仪(Syngene，英国)；强迫游泳实验仪器(上海欣软)。

二、研究方法

1.围绝经期大鼠造模：20只雌性SD大鼠均采用卵巢去势形成围绝经期大鼠模型。所有大鼠用2%戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉成功后，行双侧卵巢切除术。手术方法：大鼠取俯卧位，于背部中1/3处剪毛，用碘伏常规消毒手术区域的皮肤，自腰椎沿背部正中线向下做纵行切口约2～3 cm，切开皮肤，分别于左、右两肋下剪开腰肌，暴露卵巢及紧密相连的子宫角，在子宫角上结扎两侧，并切断，将卵巢摘出，缝合皮肤[10]。术后连续5 d皮下注射庆大霉素预防感染。第6天开始作阴道细胞学涂片，具体方法为：将无菌棉签用无菌生理盐水浸湿后插入大鼠阴道，充分沾取分泌物后取出，于清洁载玻片上涂片，用95%乙醇固定，在光学显微镜下观察阴道脱落细胞角化指数(cornification index，CI)，1次/d，连续5 d，CI低于50%者为造模成功。

2.围绝经期抑郁大鼠造模：成功建立围绝经期大鼠模型后第12天，随机选取10只大鼠为实验组进行抑郁造模，采用慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)[11]诱导大鼠抑郁。CUMS方案包括不同的应激源，连续刺激28 d，每种应激给予3次～4 次，连续 2 d 内不能出现相同应激。应激刺激随机排列如下：倾斜鼠笼 17 h；禁食、禁水20 h；湿笼 21 h；持续光照 17 h；电击(30 V电压)足底5 s；夹尾 1 min；行为限制2 h；4℃冰水游泳(水深以大鼠的后足尖能触及桶底为准)5 min。造模结束后进行行为学评估。

3.大鼠体重测量和行为学评估：(1)体重测量：通过应激刺激前后体重变化评估大鼠负性行为。在CUMS实验开始前测定大鼠基线体重，应激刺激开始后每周固定时间记录两组大鼠体重。(2)糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT)：待测大鼠禁水禁食12 h 后，单笼观察1 h，鼠笼上放置1%的蔗糖水和普通饮用水各1瓶，自由饮用，分别称量1 h前、后两水瓶的重量，将两次数值相减分别得出糖水饮用量和普通水饮用量。糖水偏爱率=糖水饮用量/(糖水饮用量+普通水饮用量)。(3)强迫游泳实验(forced swimming test，FST)：将大鼠放入直径20 cm、高50 cm的圆柱形水缸，水深约40 cm，每次观察 2 只。实验开始后60 s为适应时间，适应结束后记录5 min内大鼠不动时间。(4)旷场实验(open field test，OFT)：测试前先将待测大鼠放入100 cm×100 cm×50 cm的无盖方箱(旷场)中30 min 以适应环境，用Smart 3.0软件将旷场划为16个格子，中间4个格为中央区，其他12个格为周围区。开始时将实验大鼠头部背对实验者轻缓放入旷场实验箱中央区，大鼠在旷场中先适应30 s，然后进行摄像记录5 min内的活动情况，统计大鼠在旷场的中央区运动总距离。每次测量前均用10%的酒精清洗实验箱，以消除上一次大鼠留下的嗅觉刺激(如气味、大小便等)。

4.大鼠粪便标本的收集：围绝经期抑郁大鼠造模成功后处死两组大鼠，无菌条件下取两组大鼠结肠内的粪便，置于无菌1.5 ml离心管中，-80℃低温冰箱保存待测。

5.大鼠粪便肠道菌群总DNA提取及PCR检测：按照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书提取肠道菌群总DNA，并用紫外分光光度计检测提取的DNA纯度，A260/A280比值在1.8～2.0。选择细菌16S rRNA-V3区的通用引物(V3-F/V3-R)对提取的肠道菌群总DNA进行PCR扩增，使用50 μl PCR反应体系：上、下游引物(表1，10 μmol/L)各2 μl，dNTP(2.5 mmol/L)1 μl，MgCl2(2.5 mmol/L)5 μl，10×buffer 5 μl，Taq DNA(5 U/μl)0.4 μl，DNA模板2 μl，H2O 32.6 μl。上游引物5’端延伸添加GC夹(序列为CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)，产物为233 bp，有利于提高PCR产物在变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)中的分离效率。采用Touch down PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，65℃退火1 min(每2个循环退火温度降低1℃，至退火温度降到55℃)，72℃延伸1 min，共进行20个循环；95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，在此退火温度再进行10个循环；72℃ 7 min，4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件6 V/cm，30 min，采用溴化乙锭染色20 min，之后使用紫外成像分析系统拍照。

表1 大鼠肠道菌群V3区通用引物序列

6.DGGE检测大鼠肠道菌群的变化：DGGE分析使用美国Bio-Rad公司DCode TMUni Versal Mutation检测系统进行，胶板大小为16 cm×10 cm×1 cm。根据PCR产物大小选择浓度为8%的聚丙烯凝胶，通过垂直变性梯度电泳确定最适用于本实验PCR产物的变性梯度范围(由上到下)为30%～65%，将1×TAE电泳缓冲液预热至60℃后放入胶板，150 V电压预电泳30 min后，取PCR扩增产物10 μl与6×上样缓冲液混匀后注入上样孔中，即可开始电泳：全程60℃，60 V电压电泳1 h，之后以90 V电压电泳14 h。待电泳完毕后，将板间的变性聚丙烯凝胶放入溴化乙锭溶液中染色20 min，在紫外下使用凝胶成像系统拍照保存，分析图像。使用Quantity One(Bio-Rad，美国)对所得DGGE图谱进行软件分析，检测各组样本的条带数、灰度值等用于分析粪便细菌类型的多样性。使用基于非加权配对算术平均法 (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)聚类分析各菌落相似性，计算出Dice相似性系数(Cs)。香农指数(H’)是一反映微生物菌落多样性的指数，值越大，说明菌群的多样性越丰富。

三、统计学分析

结 果

一、大鼠体重的比较

抑郁症的临床表现包括食欲不振。进入实验前和CUMS刺激第1周，实验组大鼠体重与对照组无显著差异(P>0.05)；CUMS刺激第2周～第4周，实验组体重均较对照组显著下降(均P<0.05)，且随着时间的推移，体重不断减轻(表2)。

表2 两组大鼠进行CUMS刺激前后体重的比较[g，(-±s)]

二、大鼠行为学指标比较

快感缺乏、自发活动减少和绝望无助是抑郁症的重要表现。糖水偏好实验可以检测大鼠是否有快感缺乏，旷场实验可反映大鼠的自发活动，强迫游泳实验可检测大鼠是否具有绝望无助行为的表现。CUMS刺激4周后，与对照组大鼠相比较，实验组大鼠糖水消耗率显著下降(P<0.05)，旷场中央区域活动距离显著减少(P<0.05)，强迫游泳悬浮不动时间显著延长(P<0.05)，提示 CUMS 抑郁造模成功(表3)。

表3 两组大鼠行为学指标的比较(-±s)

三、大鼠肠道菌群PCR扩增结果

选择细菌16S rRNA-V3区的上、下游引物(V3-F-GC/V3-R)对提取的两组大鼠肠道菌群总DNA进行PCR扩增，产物为233 bp；阳性对照为标准菌株的DNA，阴性对照未添加细菌DNA。结果在200 bp附近获得清晰条带，符合预期大小，为目的条带(图1)。

M：Marker；+：阳性对照；-：阴性对照； 1～5：对照组；6～10：实验组图1 两组大鼠肠道菌群总DNA的PCR结果

四、大鼠肠道菌群的比较

DGGE条带数和香农指数(H’)反应肠道菌群的多样性。实验组大鼠DGGE条带数和香农指数均显著低于对照组大鼠(P<0.01)；Dice相似性系数(Cs)可反映菌群相似性，实验组大鼠组内相似性显著下降(P<0.01)，组间相似系数仅为(54.84±11.07)(表4)。

五、大鼠肠道菌群UPGMA聚类分析

将两组大鼠肠道菌群DGGE指纹图谱进行UPGMA聚类分析，结果显示两个组别样本具有各自聚集的趋势，提示每组个体的组内相似性高于组间相似性，表明两组大鼠肠道菌群结构具有明显差异，提示两组之间相似性较低，实验组大鼠肠道菌群结构趋于紊乱(图2)。相似系数累积分布曲线表示与对照组大鼠相比，实验组大鼠个体间肠道菌群相似性显著降低(曲线越靠近X 轴，组内相似性越高)(图3)。

表4 两组大鼠肠道菌群的比较(-±s)

#1～#5：对照组；#6～#10：实验组图2 两组大鼠肠道菌群DGGE图谱UPGMA聚类分析

图3 两组大鼠肠道菌群相似性系数累积分布曲线

讨 论

围绝经期是女性绝经前后的一段时期，此时卵巢功能逐渐衰退，雌激素水平波动性下降引起植物神经功能紊乱，出现一系列躯体及精神心理症状，称围绝经期综合征。具体表现为潮热、出汗、心悸、疲乏、头痛、失眠、情绪波动等特有症状，还易伴发焦虑、抑郁等多种心理问题。围绝经期是女性心理、社会、生物因素交互作用明显的时期，抑郁发生率上升且达到峰值[12]。围绝经期抑郁女性的身体健康和生活质量明显下降，生活和工作受到严重困扰，甚至有些女性自杀。围绝经期女性对这一阶段雌激素水平变化的敏感性增加是围绝经期抑郁发生的一个关键病因[13]。

肠道菌群种类繁多，数目庞大，已成为机体重要的组成部分，参与维持各项生理功能。肠道菌群对人类健康和疾病的影响已经引起了广泛的关注和重视[14-15]。研究证明，肠道微生物及其代谢产物通过神经、内分泌、免疫途径影响大脑，同时机体也通过此途径调节肠道菌群的构成，使肠道微生态保持平衡，即肠道微生物-脑-肠轴[16]，该学说认为肠道菌群参与了中枢神经系统的调控，且已在分子生物学中得到证实[17]。机体与肠道菌群之间有益的相互作用是机体建立和维持健康的关键，肠道菌群正常，可调节宿主免疫系统，影响机体的生长发育、生理功能和新陈代谢[18-19]。肠道菌群与年龄有关，从婴儿至老年肠道菌群发生了巨大的变化[20]。机体受到严重打击时肠道菌群也会发生变化，如乳杆菌数量减少[21]。围绝经期女性可出现一系列绝经相关症状，加之处于所谓的“多事之秋”，易受外界因素影响从而更易引起消化系统微生物菌群的改变。研究报道已证实更年期综合征妇女的肠道微生物菌群发生显著变化[22]。

肠道菌群的组成和多样性与抑郁密切相关[23]，抑郁动物模型证实了抑郁动物与正常动物肠道微生物具有明显差异，这种差异与抑郁症患者的肠道微生物失调具有相似性[24-25]。PCR结合DGGE技术为研究肠道微生态提供了便捷方法，广泛用于肠道复杂微生物区系多样性分析和菌群结构变化的研究[26]。本研究对围绝经期抑郁大鼠的肠道菌群进行PCR-DGGE试验并进行指纹图谱分析，探讨其肠道菌群的微生态状况，发现与正常雌性围绝经期大鼠相比，接受CUMS刺激发生抑郁的雌性围绝经期大鼠，DGGE胶条带数目和香农指数显著减少，说明肠道菌群多样性显著下降，Dice相似性系数提示组内和组间的相似性显著降低，表明菌群的稳定性下降，肠道菌群结构发生显著改变，趋于紊乱。最新研究报道调节肠道菌群改善肠道微生态可能成为抑郁治疗的新靶点，开启抑郁治疗的新篇章[9]。应用益生菌调节肠道菌群，可有效改善宿主焦虑、抑郁、认知功能、自闭、应激反应等一系列神经系统功能失调[27]，本研究结果启发我们可以尝试改善肠道微生态用以治疗围绝经期抑郁。

肠道菌群有效参与调控机体的复杂生理过程，与机体的身心健康密切相关，本研究以围绝经期抑郁大鼠为模型，研究其肠道菌群结构，发现围绝经期抑郁大鼠肠道菌群紊乱，微生态失调，肠道菌群多样性显著降低，个体间和组间相似性也显著降低，肠道微生态失调又会加重机体的生理平衡紊乱，导致情绪障碍加重或持续存在。越来越多的动物实验证明益生菌的应用有益于改善中枢神经系统功能，我们可以尝试改善围绝经期抑郁患者的肠道菌群，恢复益生菌的数量和功能，或许有益于抑郁的防治。