胚胎形态动力学参数与胚胎整倍性的关系

邹曜宇，徐彦，谷瑞环，李志超，伏静，孙贻娟

(复旦大学附属妇产科医院上海集爱遗传与不育诊疗中心，上海 200011)

胚胎染色体异常是导致胚胎着床失败和反复流产的主要因素，给人类辅助生殖技术(ART)带来了严重障碍。近年来胚胎植入前遗传学检测(PGT)技术的应用有效避免了染色体异常导致的妊娠失败或新生儿缺陷，显著提高了移植成功率和活产率[1]。但是，PGT的操作存在一定局限性：(1)费用不菲，等待时间长，且必须先行胚胎冷冻；(2)操作复杂，操作的侵入性和复杂性可能导致错误的结果[2]；(3)为有创性检测，目前缺乏对新生儿乃至子代健康状况的长期随访，故可能存在一定的安全隐患。因此，建立快速、无创、安全、可靠的方法预测胚胎整倍性，将对辅助生殖工作带来巨大的帮助。

时差成像技术(Time-lapse)是近年来发展的一项无创胚胎培养技术，可获取胚胎发育各阶段的形态，记录特定事件发生时间，被越来越多地应用于研究胚胎发育潜能和整倍性预测。但是，利用该技术获得的胚胎形态动力学参数是否与染色体整倍性之间存在联系尚无统一结论，有效参数如何选择也一直存在很大争议[3-7]。为了解决这一问题，本研究比较了形态动力学参数在整倍体和非整倍体胚胎之间的差异，旨在为更好地实施选择性单胚胎移植奠定可靠的理论基础。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016年6月至2019年12月间在复旦大学附属妇产科医院上海集爱遗传与不育诊疗中心接受第三代试管婴儿治疗的150例患者的临床资料。女方年龄23～49岁。纳入标准：患者不孕年限≥1年；满足PGT指征，包括夫妻双方或一方为遗传病患者或携带者/反复种植失败/不明原因反复流产/高龄(年龄≥38岁)。

纳入患者共获得561枚评分在4BC/4CB及以上的可用囊胚。由于无法对逆分裂胚胎进行形态动力学参数标记，故去除了逆分裂胚胎共11枚，最终550枚胚胎纳入统计分析。根据囊胚整倍性分为整倍体胚胎组(250枚)和非整倍体胚胎组(300枚)，并对两组胚胎进行比较。

二、方法

1.控制性促排卵：采用常规拮抗剂或短期GnRH激动剂促排方案，当B超监测下至少有1个优势卵泡平均直径达18 mm以上时，于当晚注射人绒毛膜促性腺激素(HCG，珠海丽珠)，36 h后在超声引导下经阴道行卵泡穿刺，获得卵母细胞复合物。

2.胚胎体外培养：卵母细胞采集后剥除颗粒细胞，选出MⅡ卵，2～4 h后行ICSI注射。胚胎立刻放置于Time-lapse培养箱EmbryoScope(Vitrolife，瑞典)的培养皿Embryoslide(Vitrolife，瑞典)中，培养环境6%CO2、5%O2、37℃，在G-1培养液(Vitrolife，瑞典)中培养至受精后66～68 h(D3)，短暂取出换成G-2培养液(Vitrolife，瑞典)并透明带激光打孔，继续培养至授精后113～139 h(D5～D6)。Time-lapse机器拍摄间隔频率为15 min，有效监测胚胎发育全过程。选择D5或D6发育至囊胚、Gardner评分[8]在5BC/5CB及以上的可用囊胚且未发生逆分裂的胚胎共550枚纳入分析。

3.单核苷酸多态性(SNP)芯片检测：在D5或D6选择5BC/5CB及以上的可用囊胚进行滋养层细胞活检，将活检胚胎置于显微操作皿中，用显微固定针固定胚胎，活检针轻轻吸取孵出的滋养层细胞，利用激光破膜仪(Hamilton Thorne，美国)切割4～5个细胞。通过REPLI-g Single Cell Kit 试剂盒(Qiagen，德国)对获取的胚胎滋养层细胞进行全基因组扩增。扩增产物应用Human Cyto-12 microarray芯片(Illumina，美国)进行第二轮扩增、DNA片段化、沉淀、重悬、芯片杂交、洗涤、SNP单碱基延伸、着色等。芯片结果通过iScan reader仪(Illumina，美国)扫描，并利用Bluefuse-Multi软件(Illumina，美国)进行胚胎染色体拷贝数变异分析。

4.胚胎评估：利用EmbryoViewer软件(UnisenseFertilitech，丹麦)记录胚胎发育过程中的时间参数。14个胚胎早期形态动力学参数：以授精时间为起点，第二极体排出时间标记为tPB2，原核出现和消失时间分别为tPNa和tPNf，发育至2细胞至8细胞的时间分别为t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8，第二、三个细胞周期间隔时间为cc2(t3-t2)和cc3(t5-t3)，标志第二、三次细胞分裂同步性指标分别为s2(t4-t3)和s3(t8-t5)；5个晚期形态动力学参数：开始致密化的时间为tC，形成桑椹胚时间为tM，形成囊胚时间为tSB，囊胚孵出时间为tHB。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般情况及胚胎一般资料

纳入患者的平均年龄为(32.20±4.61)岁，平均体重指数(BMI)为(21.73±2.92) kg/m2。PGT指征中，94例(62.67%)为遗传病患者或携带者，11例(7.33%)为反复种植失败患者，42例(28.00%)为反复流产患者，3例(2.00%)为高龄患者。68例患者(45.33%)采用短方案促排卵，82例患者(54.67%)采用拮抗剂方案促排卵。患者的基础FSH、E2、LH、P、抗苗勒管激素(AMH)水平分别为(7.40±1.78)U/L、(169.31±71.30)pmol/L、(5.49±4.36)U/L、(2.12±3.04)nmol/L和(5.00±3.29)ng/ml。平均获卵数、D3有效胚胎数和可用囊胚数分别为(14.24±6.04)枚、(8.85±4.18)枚和(3.53±2.25)枚。

二、早期形态动力学参数比较

对授精至卵裂前的形态动力学指标进行比较，整倍体胚胎和非整倍体胚胎的tPB2、tPNa与tPNf比较无显著性差异(P>0.05)。对卵裂期的形态动力学指标进行比较，整倍体胚胎的t4和s2均显著小于非整倍体胚胎(P<0.05)，t2、t3、t5、t6、t7、t8、cc2、cc3和s3两组间比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 整倍体和非整倍体胚胎的早期形态动力学参数比较[h，M(P25，P75)]

三、晚期形态动力学参数比较

对胚胎致密化后的晚期形态动力学参数进行比较，整倍体胚胎的tHB显著小于非整倍体胚胎(P<0.05)，tC、tM、tSB、以及囊胚孵出与囊胚形成的间隔时间(tHB-tSB)的两组间比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 整倍体和非整倍体胚胎致密化后形态动力学参数比较[h，M(P25，P75)，(-±s)]

讨 论

选择最具发育潜力的胚胎，获得单胎、足月的健康子代是辅助生殖工作的宗旨。然而年轻女性体外授精后D3胚胎的非整倍体概率约为65%，D5囊胚的非整倍体概率约为45%，且这一比例在35岁以上女性中更高[9]，即使在自然人群中染色体异常概率也有约0.5%[10]。因此，如何在大量胚胎中剔除非整倍体胚胎、挑选出最具发育潜能的胚胎和整倍体胚胎，以得到良好的临床结局是生殖技术的目标[11]。目前已有一些研究希望借助无创的囊胚液或培养液中胚外DNA检测对胚胎整倍性进行预测[12]，但这些方法经济成本较高，耗时长，且准确性有待提高。

近年来Time-lapse技术在辅助生殖领域大量应用，研究者发现胚胎的形态动力学蕴含了大量关于胚胎发育潜能的信息[13-14]，借助Time-lapse系统进行整倍性预测，不仅具有无创、快速、安全性高的特点，而且成本低，具有较为突出的优点。然而关于各项技术指标的有效性仍未达成共识，已有多篇文章认为卵裂期和(或)囊胚期的形态动力学参数可以预测胚胎整倍性，但是有效指标不尽相同，预测方法也不一样[3，6，15-16]；也有学者认为Time-lapse并不能帮助预测胚胎整倍性[5，7，17-18]。这些差异可能是由不孕原因、促排方案、染色体异常情况、胚胎培养液和培养气体环境等因素不同导致[19]，也可能与研究方法不同有关，例如有些研究对年龄等混杂因素进行了校正[4，7，20]，而有些则没有校正[16-17]。

在本研究中，由于逆分裂胚胎无法标记其细胞分裂时间点，且多项研究表明逆分裂胚胎的移植成功率为0%[21-22]，因此本研究均以未发生逆分裂的胚胎作为研究对象。本研究结果显示整倍体和非整倍体胚胎的t4和s2存在显著性差异，表明非整倍体胚胎发育至四细胞的时间延长、第二次细胞周期同步性较差。我们发现s2在整倍体和非整倍体胚胎间的中位数相差很小(0.01 h)，但第三分位数相差较大(0.25 h)，提示非整倍体胚胎的s2分布向后偏移，即有较多非整倍体胚胎的三、四细胞发育间隔较长。胚胎发育是一个有序且复杂的过程，多个阶段都可能发生染色体异常，包括受精前的卵源性染色体非整倍性及染色体变异拷贝数异常，体外授精过程中因环境变化和体外操作导致的染色体重组、排列和分离异常，以及后续每一次细胞分裂都可能存在的染色体复制和分离异常。染色体状态是胚胎的内在因素，合适的细胞分裂时间与染色体状态保持着一定联系，例如，一旦姐妹染色单体错误附着在纺锤体微管上，M期细胞周期检验点将被激活，继而启动修复过程，但这一过程延长了细胞周期，使得细胞分裂变慢，因此分裂过慢可能提示发生了DNA损伤或染色体畸变[23]。如果细胞周期检查点也发生了错误，将导致非整倍体的出现。这可能可以解释非整倍体胚胎的t4、s2比整倍体胚胎延长的原因。在临床工作中，优先选择t4数值小的胚胎、同时降低s2较大胚胎的移植顺序，可能会提高整倍体胚胎的选择概率，提高胚胎种植率、降低流产率，后续工作中需要对此进行深入研究。

本研究结果还发现，致密化后两组胚胎间tC和tM比较没有显著性差异，非整倍体胚胎的tSB具有增大的趋势，但尚无显著性差异(P=0.095)，直至tHB两组间出现了显著性差异，提示非整倍体胚胎在致密化后逐渐发育减慢。囊胚的孵出时间直接影响与移植窗口期的对接，因此具有重要的临床意义。由于我们在胚胎发育D3进行了人工辅助孵化，因此该数据并不能完全反映自然情况下的囊胚孵出时间。但是，tHB更短的胚胎可能具有更强的活力，优先选择tHB短的胚胎进行移植可能会提高整倍体胚胎的选择概率，提高胚胎种植率。

Minasi等[4]通过对928枚囊胚进行滋养层细胞活检，比较基因组杂交芯片染色体检测和胚胎形态动力学参数，发现整倍体胚胎的t4、 s2和tHB显著短于非整倍体。我们的研究结果与之相似。但由于不同中心得出的有效指标不尽相同，多中心大样本研究可能具有更加广泛的意义。通过Time-lapse平台获取的胚胎形态动力学参数不仅在区分整倍体和非整倍体胚胎中具有一定作用，还可预测D3胚胎发育成囊胚的潜能[13-14]、预测移植胚胎的临床结局[24]，并且与传统胚胎选择方法相比，利用 Time-lapse技术选择早期胚胎，可以在显著减少移植胚胎数的基础上，维持稳定的临床妊娠结局[25]，因此Time-lapse具有巨大的临床应用前景。这些研究均发现第2次细胞周期分裂同步性较好的胚胎即s2短的胚胎具有更强的发育潜能，提示形态动力学参数s2是胚胎选择的重要参考指标[13-14，24]。

综上所述，本研究结果表明，采用常规促排方案、对满足PGT指征患者的胚胎在EmbryoScope机器中行G1G2序贯培养，于D3行激光辅助孵化后，发育至有效囊胚的早期形态动力学参数t4、s2和晚期形态动力学参数tHB可能成为预测胚胎整倍性的有效指标。由于在辅助生殖工作中难以对染色体状态等影响胚胎发育潜能的关键因素进行及时的判断，利用Time-lapse技术进行胚胎选择可能具有重要的参考意义。