MLH1、PRMT5在卵巢癌组织中的表达及意义

白璐，吴利英，吕艳红，杨红

(中国人民解放军空军军医大学第一附属医院妇产科，西安 710032)

卵巢癌是最为常见的恶性肿瘤之一，目前排在妇科恶性肿瘤的第三位，近年来发病率呈现升高趋势，手术治疗是临床根治卵巢癌的方法之一，但是术后患者存在较高的复发转移率，因此通过寻找早期可靠的血清学指标对卵巢癌病情发展变化进行判断对于改善患者治疗效果具有重要意义[1]。错配修复蛋白MutL同系物1(MLH1)属于人体DNA错配修复基因家族重要的成员，其突变后会导致修复基因的功能缺失，诱导肿瘤发生。蛋白质精氨酸甲基化在生物体内广泛存在且具有重要作用，精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)属于催化此过程的关键酶，对细胞增殖、凋亡均具有重要作用，在多种恶性肿瘤呈现过度表达，但是对于两种因子在卵巢癌中的研究相对少见[2]。本研究分析了MLH1和PRMT5在卵巢癌组织中的表达情况，以期为临床提供指导和依据。

资料与方法

一、研究对象

选取2017年1月至2019年8月中国人民解放军空军军医大学第一附属医院保存的卵巢癌组织标本132例作为卵巢癌组。纳入标准：(1)均经病理学确诊；(2)术前未行放化疗等抗肿瘤治疗；(3)临床资料保存完整。排除标准：(1)合并有其他系统恶性肿瘤者；(2)合并有自身免疫系统疾病、血液系统疾病等其他严重基础性疾病。选取同期因全子宫双侧附件切除术获得的正常卵巢组织80例作为对照组。

二、试剂与方法

1.主要试剂及仪器：MLH1与PRMT5小鼠抗人单克隆抗体、DAB 染色液(北京中杉金桥)；Leica ASP300 S组织脱水机、Leica EG1150石蜡包埋机、Leica RM2255转轮切片机(莱卡，德国)；苏泊尔YL206 G1高压锅(苏泊尔，法国)；DNP-9272电热恒温箱(上海精宏)。

2.实验方法：采取免疫组化法对MLH1和PRMT5进行测定。标本在4%中性甲醛溶液中进行固定6 h，石蜡包埋后进行切片，厚度为3 μm；58℃烤箱烘干溶蜡3 h，石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精进行水化，高压锅抗原热修复3 min，PBS洗涤3次；一抗(稀释比例1∶100)4℃孵育过夜后再次PBS洗涤3次，滴加二抗(稀释比例1∶100)PBS洗涤3次；DAB显色后自来水冲洗10 min，苏木精复染60 s，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗返蓝、脱水，中性树胶封片。随机计数10个高倍视野，计算每个高倍视野中阳性细胞所占百分比，阳性细胞率大于20%为阳性表达，按照阳性表达例数与总例数计算阳性表达率。

三、统计学分析

统计分析采用SPSS 22.0软件。计数资料比较使用χ2检验，相关性采用Spearman秩相关分析，生存曲线采用Kaplan-Meier法描绘，比较采用Log-rank检验。检验水准α=0.05。

结 果

一、卵巢癌和正常卵巢组织中MLH1、PRMT5的表达

MLH1、PRMT5主要表达于卵巢上皮细胞的胞质中(图1)。卵巢癌组MLH1阳性表达率显著低于对照组(P<0.05)，而PRMT5阳性表达率显著高于对照组(P<0.05)(表1)。

A：卵巢癌组MLH1(×400)；B：卵巢癌组PRMT5(×400)；C：对照组MLH1(×200)；D：对照组PRMT5(×200)图1 MLH1和PRMT5在卵巢组织中的定位(免疫组化染色)

表1 卵巢癌和正常卵巢组织MLH1、 PRMT5表达率[n(%)]

二、MLH1、PRMT5表达与卵巢癌临床病理特征关系

FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期组织MLH1阳性表达率显著低于Ⅰ～Ⅱ期组织(P<0.05)；FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化和有淋巴结转移组织PRMT5阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化和无淋巴结转移组织(P<0.05)(表2)。

表2 MLH1、PRMT5表达与卵巢癌临床病理特征关系

三、卵巢癌组织中MLH1和PRMT5相关性分析

MLH1阳性PRMT5阴性的病例有44例，MLH1阴性PRMT阳性的病例有61例，二双阳性和双阴性分别只有21例和6例，卵巢癌组织中MLH1与PRMT5表达呈负相关(rs=-0.605，P<0.05)(表3)。

表3 卵巢癌组织中MLH1和PRMT5相关性分析

四、MLH1与PRMT5表达与预后的关系

MLH1阳性/PRMT5阴性表达患者中位总体生存时间为19.80(12，25)个月，显著高于MLH1阴性/PRMT5阴性患者[12.40(7，14)个月]、MLH1阳性/PRMT5阳性患者[10.40(6，14)个月]和MLH1阴性/PRMT5阳性患者[8.40(5，10)个月](P<0.05)(图2)。

A：MLH1阳性/PRMT5阳性；B：MLH1阳性/PRMT5阴性； C：MLH1阴性/PRMT5阳性；D：MLH1阴性/PRMT5阴性图2 不同MLH1与PRMT5表达组的生存曲线

讨 论

卵巢癌是临床女性最为常见的恶性肿瘤之一，几年来发病率呈现升高趋势，对女性生命健康和生活质量产生严重威胁，有报道指出卵巢癌的分期对患者预后产生严重影响，I期患者五年生存率可高达90%以上，而晚期卵巢癌患者五年生存率则仅为25%左右[3]。目前临床卵巢癌患者多数就诊时已处于中晚期，失去了手术根治的机会，因此早期诊断对于指导临床治疗和改善预后具有重要意义[4-5]。传统的诊断方法是采取组织学检查，但是卵巢的位置极为特殊，因此组织学检查在卵巢癌的早期诊断中价值有限[6]。影像学检查一直也是卵巢癌诊断的重要方法，常用的有超声、CT以及核磁共振检查，但是在检查过程中可能受到医师主观因素影响，而且部分检查具有辐射性，且费用高昂，在基层医院使用受到限制[7-8]。血清学指标虽然是临床诊断卵巢癌的重要依据，但是肿瘤标记物种类较多，而且影响因素较多，在部分子宫内膜异位或者盆腔炎症病变中也会升高，因此临床特异性不高[9]。近年来大量研究发现肿瘤最主要的生物学特征是侵袭与转移，正常细胞在病理状态下失去了极性转换的活动能，肿瘤细胞在原发灶生长增殖，随着黏附松解而脱落，同时释放多种蛋白水解酶水解胞外基质、基膜，组织间隙被破坏导致肿瘤细胞向局部浸润或经循环系统向远处纵深发展[10-11]。

本研究MLH1和PRMT5在卵巢癌组织中的表达情况，目前认为人体基因失活一方面是遗传学机制造成，基因缺失或者突变均会导致基因序列改变，属于不可逆性改变，另一方面表观遗传学机制则是核苷酸序列未出现变化，基因通过化学修饰包括甲基化、非编码等造成基因表达受到影响，具有可逆性[12-13]。错配修复基因功能异常是导致肿瘤基因激活、抑癌基因失活和细胞周期改变的重要原因，最终会导致细胞发生恶变与肿瘤发生发展。MLH1是错配修复基因家族重要的成员，该基因启动子出现高甲基化后表达水平降低，造成DNA碱基错配修复能力降低，DNA复制过程出现错误，诱发了肿瘤的发生[14]。既往研究认为MLH1属于细胞保护性蛋白，MLH1蛋白缺失也会造成肿瘤细胞难以应对DNA损伤时对肿瘤细胞自身的影响，而且在结直肠癌的研究中发现其基因表达同肿瘤生物学行为关系密切，但是基因表达同肿瘤分级、分期和淋巴结转移则不具有相关性[15-16]。人体正常细胞的增殖分化依靠细胞有序的周期性活动，PRMT5对细胞周期G1期调控具有重要作用[17]。有学者在乳腺癌患者中研究发现PRMT5会引发G1期阻滞、S期显著缩短，从而抑制细胞增殖过程[18]。还有学者证实了PRMT5表达下降后细胞周期转录因子-1的表达会升高，抑制细胞生长，PRMT5直接甲基化还会导致细胞凋亡增加，但是临床对于其在卵巢癌中的具体作用机制还未明确[19]。目前证实PRMT5在细胞正常生长、分化和发展方面具有关键作用，其过度表达同肿瘤细胞的过度增长有关，通过抑制其表达可以引发抑癌基因的转录抑制和细胞生长变慢，说明其具有成为卵巢癌基因治疗靶基因的潜力[20]。

本研究显示，卵巢癌组织MLH1阳性表达率明显低于正常卵巢组织，而PRMT5阳性表达率明显高于正常卵巢组织，说明在卵巢癌组织中MLH1阳性降低，PRMT5阳性表达升高。FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期组织MLH1阳性表达率显著低于Ⅰ～Ⅱ期组织；FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化和有淋巴结转移组织PRMT5阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化和无淋巴结转移组织，说明MLH1同卵巢癌分期有关，而PRMT5同卵巢癌的分期、分化程度以及是否存在淋巴结转移有关。通过相关性分析发现，卵巢癌组织MLH1与PRMT5表达呈负相关。通过绘制生存曲线分析发现，MLH1阴性PRMT5阳性表达患者中位总体生存时间19.80个月长于MLH1阴性PRMT5阴性、MLH1阳性PRMT5阳性和MLH1阳性PRMT5阴性患者，这有助于对临床医师对患者预后进行早期预判。本研究优势在于证实了卵巢癌组织中MLH1与PRMT5表达情况，为临床合理寻找评估患者分期、分化程度以及淋巴结转移寻找了新的分子生物学指标，但是本研究随访时间短，入组患者数量较少，而且受到多种因素影响可能导致结果存在偏倚，因此还需扩充样本量、长期随访深入分析。

综上所述，卵巢癌组织MLH1表达下调而PRMT5表达上调，与临床病理特征有一定关系，值得进一步研究。