人工周期冻融胚胎移植后黄体支持中添加HCG的前瞻性随机对照研究

黄愈，师娟子，李娜*

(1.西安医学院，西安 710003；2.西安交通大学附属西北妇女儿童医院辅助生殖中心，西安 710003)

在冻融胚胎移植(FET)周期中，人工周期(HRT)准备内膜由于使用外源性雌孕激素促进子宫内膜的增殖与转化，使用方便，可控性强，因此成为了常用的准备内膜方式。但由于HRT周期无黄体生成，胚胎移植后需要足量、全程的黄体支持[1]。

既往的研究认为HCG是利用其与LH相似的结构作用于LH受体，刺激黄体细胞产生雌孕激素进行黄体支持。随着对HCG及其受体研究的深入，发现HCG在人类生殖的每一步均起着重要的作用[2]。目前对于黄体支持中使用HCG是否可以改善妊娠结局仍存在争议。考虑到HRT-FET周期无黄体形成，排除了HCG刺激黄体对妊娠的积极作用，可以反映HCG是否是通过改善母胎界面的交互作用从而改善临床结局，进而为HCG在临床中的合理应用提供依据，因此对我中心行HRT-FET周期的患者进行前瞻性随机对照研究。

资料与方法

一、研究对象

本研究自2018年11月1日至2019年10月31日选取在西北妇女儿童医院生殖中心行FET的患者进行前瞻性随机对照研究。

1.纳入/排除标准：年龄<40岁；FET第一周期；HRT准备内膜(包括GnRH-a+HRT方案)；排除子宫内膜异位症、子宫畸形、转化日子宫内膜厚度<8 mm以及进入其他研究的患者。

2.样本量计算：研究设计为非劣性检验，把握度β 80%，取α双侧0.05，临床妊娠率差异15%，得到样本量每组150例。

3.随机化方案：计算机随机产生300个随机号码，分为A、B两组，每组各150个。制作随机分组表，计算机保存并隐藏。将上述获得的300个随机号码，再次随机分配给300个序列号。每入组一例患者，根据入组序列，输入姓名、病历号后获得一个随机号码，由计算机揭盲分组组别，不能更改。

4.依从性分析：对纳入患者进行依从者分析。依从者分析是指在分析中除去部分依从性不足的患者，仅对执行方案者进行分析。

本研究经我院伦理委员会审批通过并备案(伦理审批编号：2018027)。本研究临床试验注册号：ChiCTR1800020342。每位患者在入组前均签署书面知情同意书。

研究流程见图1。

图1 研究流程图

二、研究方法

1.促排卵方案：根据患者的年龄、bFSH、窦卵泡情况选择GnRH激动剂(GnRH-a)、拮抗剂(GnRH-ant)、其他方案进行促排卵。当平均直径≥17～18 mm的卵泡占到平均直径≥14 mm卵泡数量的60%以上时使用HCG扳机，常用剂量为HCG(珠海丽珠医药)4 000～10 000 U肌肉注射或艾泽(默克雪兰诺，瑞士)250 μg皮下注射，注射后36 h取卵。

2.受精、胚胎培养及胚胎质量评价：根据患者丈夫精液情况，选择IVF/ICSI授精。评分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级胚胎为可用胚胎，Ⅰ级和Ⅱ级为优质胚胎。继续行囊胚培养者在D5或D6，应用Gardner评分法对囊胚进行评分[3]，3～4CC及以上为可用囊胚，3～4BB及以上为优质囊胚。

3.胚胎冷冻及复苏按我中心常规进行。

4.内膜准备及胚胎移植：单纯HRT方案于月经周期第3～5天行B超检查后采用雌激素递增方案，口服雌二醇(拜耳医药，德国)4～6 mg/d起始，雌激素递增方案，B超监测子宫内膜>8 mm时，予黄体酮注射液(浙江仙琚制药)转化内膜，根据胚龄选择移植时机。GnRH-a+HRT方案在月经周期第2～5天给予GnRH-a(博福益普生，法国)3.75 mg肌肉注射1～3周期，末次注射后30 d左右开始准备内膜，方法同上。

卵裂胚的解冻在下午进行，培养过夜后次日移植，在移植前行辅助孵化；囊胚期胚胎的解冻在早上移植前进行，过程与胚胎解冻步骤相同，解冻后行辅助孵化。解冻后卵裂胚及囊胚的评分方法同前。根据患者条件移植1～2枚卵裂胚或囊胚。

5.黄体支持：所有入组患者均在转化内膜日随机分为 2组，并签署知情同意书。(1)常规黄体支持(B组)：自胚胎移植日起黄体酮注射液(浙江仙琚制药)60 mg/d肌肉注射+地屈孕酮(雅培，荷兰)20 mg/d口服。内膜准备阶段的雌激素同前继续使用。(2)添加HCG黄体支持(A组)：在内膜转化日的第3天开始，给予HCG(珠海丽珠医药)2 000 U肌肉注射，隔日一次，连续4次。其余同常规黄体支持。

胚胎移植后根据患者意愿可将肌肉注射黄体酮换为阴道用黄体酮软胶囊(法杏，法国)0.2 g阴道置入，3次/d或黄体酮缓释凝胶(默克雪兰诺，瑞士)1.125 g，1次/d，口服地屈孕酮改为10 mg口服，3次/d。黄体支持至孕70 d逐渐减量并停药。

6.随访：卵裂胚移植后14 d测血HCG≥50 U/L、囊胚移植后9 d测血HCG≥25 U/L为HCG阳性。血HCG阳性者根据患者情况雌激素逐渐减量停药，黄体酮继续用药至孕70 天逐渐减量停药。移植后4周行阴道B超确定临床妊娠。定期通过电话随访患者。临床妊娠是指B超可见孕囊样回声(包括异位妊娠)；自然流产是指妊娠小于28周发生的流产。

7.统计指标及判定标准：D3可用胚胎率=可用胚胎数/2PN卵裂胚胎数×100%；D3优胚率=优胚数/2PN卵裂胚胎数×100%；囊胚形成率=可用囊胚数/行囊胚培养的胚胎总数×100%；种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=B超确定有孕囊的的周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、两组基线情况比较

本研究共纳入300例患者，其中A组150例，B组150例。两组完成胚胎复苏移植及随访者分别为124例及121例。两组患者间年龄、不孕年限、不孕类型、不孕因素、AFC、BMI、bFSH相比均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

二、控制性促排卵(COH)方案及实验室情况

两组患者间COH方案、授精方式、HCG日E2水平、获卵数、D3可用胚胎率、D3优胚率、囊胚形成率相比也均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表1 两组患者基线资料[(-±s)，n(%)]

表2 两组患者COH方案及实验室情况[(-±s)，n(%)]

三、FET周期临床结局

在FET周期中，A组平均移植胚胎数多于B组，A组移植囊胚比例低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)；A组胚胎种植率及临床妊娠率低于B组(分别为58.97% vs. 70.07%，66.94% vs. 74.38%)，但均无统计学差异(P>0.05)；两组自然流产率比较无统计学差异(8.43% vs.8.89%，P>0.05)(表3)。

表3 两组患者FET周期妊娠结局[(-±s)，n(%)]

四、不同移植胚胎类型的FET周期妊娠结局

1.卵裂胚移植：两组间内膜准备方案的选择无统计学差异(P>0.05)，均以单纯HRT周期方案为主；A组平均移植胚胎数略高于B组，胚胎种植率及临床妊娠率均略低于B组，但均无统计学差异(P>0.05)；A组自然流产率略高于B组，亦无统计学差异(P>0.05)(表4)。

2.囊胚移植：两组间内膜准备方案的选择中无统计学差异(P>0.05)，均以单纯HRT周期方案为主；A组平均移植胚胎数略高于B组，胚胎种植率、临床妊娠率、自然流产率均略低于B组，但均无统计学差异(P>0.05)(表5)。

表4 两组患者卵裂胚FET妊娠结局[(-±s)，n(%)]

表5 两组患者囊胚FET妊娠结局[(-±s)，n(%)]

五、二元Logistic 回归分析

通过前向法构建二元Logistic回归模型，该模型的Hosmer和Lemeshow检验拟合度χ2统计值为1.758(P=0.972)，说明该模型能够很好地拟合数据(P>0.05)。结果显示：平均移植胚胎数[OR=0.343，95%CI(0.140，0.840)，P<0.05]及移植胚胎类型[OR=2.391，95%CI(1.051，5.439)，P<0.05]对是否临床妊娠影响显著；排除平均移植胚胎数及移植胚胎类型等混杂因素，黄体支持中添加HCG对临床妊娠的影响并不显著[OR=1.466，95%CI(0.826，2.604)，P>0.05](表6)。

表6 二元Logistic回归分析

讨 论

自从1983年人类第一次通过FET技术获得妊娠以来，FET技术已经成为了辅助生殖中重要的一部分[4]。如何改善FET周期子宫内膜发育与胚胎发育的同步性，从而提高临床结局成为了临床中研究的热点。随着对HCG及其受体的研究深入，发现在胚胎发育至2PN阶段即可在胚胎培养液中检测到HCG，且其浓度与妊娠率呈正相关[5]。目前的研究发现HCG对胚胎种植及子宫内膜容受性均起着重要的作用[6-7]。但HCG是否可以改善FET周期子宫内膜发育与胚胎发育的同步性从而改善妊娠结局仍存在争议。

在本研究中，HRT-FET周期黄体支持中添加HCG对妊娠结局的改善并未起到明显的促进作用。可能性的解释或许有：(1)HCG的黄体支持作用是刺激黄体细胞产生更多内源性激素改善黄体功能。但在HRT-FET周期，并无黄体细胞，无HCG作用的靶细胞。(2)胚胎来源的HCG在局部植入位点表达的HCG量或许就足以支持母胎界面的分子对话。

Fazleabas等[8]在HRT周期中给狒狒宫腔内灌注HCG后可以诱导间质细胞和腺上皮蛋白的表达从而改善子宫内膜环境[8]；Licht等[9]发现HCG宫腔灌注后不利于胚胎植入的因子水平被显著抑制，而促进胚胎植入的因子水平显著增加。在胚胎植入时，HCG等激素的调控胚胎及子宫内膜进行信号释放及应答，通过信号途径，不断调整自身，调节母胎界面的交互作用[10]，促进胚胎植入。但张乐等[11]的Meta分析显示，胚胎移植前宫腔灌注HCG仅在移植卵裂胚，且HCG浓度>500 U时可改善妊娠结局。以上研究提示了HCG浓度及胚胎发育程度对妊娠结局的重要作用。以上研究提示了HCG宫腔灌注对妊娠结局起着积极的作用。目前临床中使用的HCG药物制剂(包括尿源性或基因重组来源者)中在胚胎植入过程中起着重要作用的高糖基化HCG(H-HCG)含量少，大部分为常规HCG；并且，HCG兼具内分泌和旁分泌作用，HCG肌肉注射后子宫内膜局部的H-HCG浓度可能更低，这也可能是宫腔灌注HCG可通过旁分泌起到促进胚胎着床的作用，而肌肉注射用药效果不佳的可能原因之一。

2017年Shiotani等[12]的研究共纳入173例HRT-FET周期的患者，在HRT周期D17和D20移植胚胎，研究组在第17、20、23天给予3 000 U HCG，结果表明添加HCG并未明显改善临床妊娠率、种植率；2012年Eftekhar等[13]对130个HRT-FET周期进行了随机对照研究，HCG组(在内膜转化日及胚胎移植日各给予HCG 5 000 U)的种植率、临床妊娠率、持续妊娠率和流产率与对照组相比均无显著差异。然而，该研究团队在随后的研究中增加样本量(200例)并改变用药方案，HCG组患者从移植日开始每72 h肌肉注射HCG 5 000 U，共3次，结果发现HCG组较对照组HCG阳性率、临床妊娠率明显增加，且流产率有降低的趋势[14]。贾学玲等[15]回顾性分析了156个HRT-FET周期，发现在HRT周期添加小剂量HCG可以改善FET患者的子宫内膜厚度、血流及妊娠结局。刘燕[16]对97例患者行前瞻性随机对照研究，均使用GnRH-a +HRT周期准备内膜，研究组在内膜达标时单次注射rHCG 250 μg，两天后予黄体酮转化内膜；与对照组(直接转化内膜)相比，胚胎种植率(42.55% vs. 21.28%，P<0.05)及临床妊娠率(59.57% vs. 38.30%，P<0.05)均显著增高，作者认为在HRT周期肌肉注射HCG可以改善临床妊娠结局。综上所述，关于在HRT-FET周期黄体支持中添加HCG的有效性，目前的研究中患者异质性很大，结果及结论也不尽相同。

我们的研究提示，在HRT-FET周期黄体支持中添加HCG并不能改善妊娠结局，且胚胎种植率有下降的趋势。因此，不建议在HRT-FET周期黄体支持中添加HCG。异常的HCG刺激还可能有害于胚胎种植。Evans等[17]比较了辅助生殖技术受孕妇女与自然受孕妇女的子宫内膜细胞培养结果，发现延长使用低剂量HCG可以下调HCG受体表达，触发HCG受体内化，使受体下游传导信号脱敏，尤其是立即使用模拟囊胚来源的高剂量的HCG后尤其严重，结果导致子宫内膜细胞粘附能力和紧密连接调节受损。

本研究的优势在于前瞻性随机对照研究，有严格纳入/排除标准，患者可比性较好。但本研究同样有其局限性，包括：最终纳入样本量小，有待扩大样本量进行研究；排除了于子宫内膜<8 mm、高龄、多周期者等条件较差的患者，可能使得研究结论的普适性有限；两组患者间移植胚胎数目及移植胚胎类型不同，有待扩大样本量细化分组分析。

综上所述，本研究发现HRT-FET周期黄体支持中添加HCG并未明显改善患者的临床妊娠结局，不建议在HRT-FET周期黄体支持中添加HCG。需要有多中心的大样本前瞻性随机对照安慰剂盲法研究，以进一步研究添加HCG在HRT-FET周期黄体支持中的有效性(包括适用人群、添加时机和方案等)以及相关机制，从而为HCG在临床的合理应用提供依据。