胚胎玻璃化冷冻后储存时间对复苏周期胚胎移植临床结局的影响

韩乐，蔡令波，孟慧，李婷，刘嘉茵

(生殖医学国家重点实验室，南京医科大学第一附属医院生殖医学中心，南京 210029)

在辅助生殖技术(ART)中，胚胎的低温保存使得周期治疗中多余的胚胎可以得到较好的使用。在胚胎冷冻保存的步骤中，存在各种类型的损伤风险，主要包括冰晶形成的机械性损伤、冷冻保护剂的渗透性损伤和降温导致的冷休克损伤等。1985年，Rall等[1]应用了“玻璃化”的创新方法，通过使用非常高浓度的冷冻保护剂和快速温度变化来最小化与冰晶形成有关的损伤。玻璃化冷冻的定义是通过使用高冷却速率增加粘度，在低温下固溶而不形成冰晶从而起到保护的作用[2]。近几年随着冷冻液配方的改进和冷冻技术的优化，玻璃化冷冻保存技术已经替代慢速冷冻技术成为最适合冷冻保存细胞和组织的方法。与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻减少了冰晶的形成[3-4]，提高了胚胎冷冻存活率、临床妊娠率和活产率[5-7]。

冻融胚胎移植(FET)在临床上主要用于以下方面：预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)；生育二孩的夫妇；不适宜新鲜周期胚胎移植的夫妇；行胚胎植入前遗传学诊断的夫妇；需要生育力保存的女性。FET周期的生理性子宫环境可能更有利于胚胎植入和胎盘形成[8-9]。有研究表明，与新鲜胚胎移植相比，FET周期提高了临床妊娠率和活产率，且冻融胚胎新生儿的出生缺陷和健康风险并无增加[10-11]。

研究表明短期玻璃化冷冻保存胚胎，复苏后不影响胚胎着床潜力或围产期结局[12]。但随着胚胎冻存时间的延长，是否会影响胚胎后续发育潜力及其围产期结局和远期婴儿健康状况如何尚不清楚。而且对于长期冷冻保存胚胎的安全性和有效性，目前的文献报道并没有得到一致的结论，值得进一步探讨。本文回顾性分析了本中心玻璃化冷冻胚胎复苏后的相关实验室指标和临床结局，以期对该技术的安全性和有效性做一初步探讨，以确保常规胚胎玻璃化冷冻保存和复苏的安全性，为进一步研究玻璃化冷冻胚胎长期低温保存对婴儿健康状况的影响奠定基础。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2014年1月至2017年12月我中心行玻璃化冷冻胚胎复苏移植的周期共计19 574个。通过临床生殖医学管理系统(CCRM)获取相关临床数据。

按照解冻时胚胎在液氮中的冻存时间分为6组：1～6个月组(15 443个周期)，7～12个月组(2 321个周期)；13～24个月组(903个周期)，25～36个月组(327个周期)，37～48个月组(224个周期)和≥49个月组(356个周期)。收集患者的基本资料、治疗方案、胚胎发育情况以及治疗结局。收集的信息包括：女方年龄、体重指数(BMI)、不孕年限、周期数、决定移植日内膜厚度、移植胚胎数、移植胚胎天数以及妊娠随访情况。新生儿分娩结局包括平均出生体重、出生性别比、低出生体重比例、死胎死产比例和畸形例数比例。胚胎复苏后各组比较胚胎复苏率、种植率、HCG阳性率、临床妊娠率、流产率、单卵双胎率等数据。

二、研究方法

1.试剂和耗材：采用COOK公司玻璃化冷冻(COOK K-SIBV-5000，COOK，美国)、解冻试剂盒(COOK K-SIBW-5000，COOK，美国)，根据说明书使用。

2.胚胎冷冻步骤：(1)使用前平衡至37℃；(2)各个冷冻液滴准确放置，每滴150 μl左右，一管胚胎一个冷冻滴；(3)将冷冻胚胎放入平衡液中，最多放3个胚胎；(4)胚胎移至平衡液(ES)，卵裂期胚胎放置4 min，囊胚放置3 min，卵子6 min。在此过程中观察胚胎的恢复状态，若胚胎未恢复可适当延长时间；(5)将胚胎移至冷冻液(VS)，吹打2～3下即吸取1.5 μl含胚胎的VS，避免产生气泡。此步在20～30 s内完成。将含胚胎的微滴放入载杆，投入液氮。

3.胚胎复苏及序贯囊胚培养：(1)准备使用前，将4种解冻溶液平衡至37℃，囊胚培养滴提前准备；(2)准备解冻滴：在3652皿底部标记好解冻滴号码；(3)将装有胚胎或卵子的载杆从液氮盒中取出并立即放入1 mol/L蔗糖，观察胚胎或囊胚的形态变化，放置约1 min；(4)将胚胎移至稀释液(DS)中，放置5 min至胚胎或囊胚完全萎缩塌陷；(5)将胚胎或卵子移至Wash 2中放置5 min，充分洗涤胚胎；(6)将胚胎或卵子移至Wash 3中放置5 min，充分洗涤胚胎；(7)将胚胎或囊胚移至之前平衡好的囊胚培养液中孵育。

4.卵裂期胚胎和囊胚评分标准：(1)卵裂期胚胎评分：400倍镜下观察分为4级。Ⅰ级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀、数目均等，细胞质均一、无空泡，碎片不超过5%；Ⅱ级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀或大致均匀、数目均等或大致均等，细胞质均一、无空泡，碎片5%～10%之间；Ⅲ级：胚胎发育速度大致正常，卵裂球不均匀/均匀、数目不均等/均等，细胞质中有少量空泡，少于15%碎片；Ⅳ级：胚胎发育速度异常，卵裂球不均匀、数目不均等，细胞质不均一、有大量空泡，10%～50%碎片。Ⅰ级和Ⅱ级为优质胚胎；I～Ⅲ级为可移植胚胎。(2)囊胚期胚胎评分：本中心囊胚评分采用 Gardner评分系统，评分级别高于CC(不含CC)的囊胚可以移植或冷冻，评分等于或低于CC的囊胚，其胚胎发育潜能低下，根据情况决定是否移植或者冷冻。

5.子宫内膜准备：采用自然周期、促排卵周期或人工周期方案准备子宫内膜，优先选择高评分胚胎行移植术[13]。

6.妊娠及分娩后情况的判断：胚胎移植14 d后测血清β-HCG。胚胎移植4～6周后阴道超声检查，观察到宫内孕囊和胎心搏动为临床妊娠。活产定义为孕周满28周，至少有1个存活新生儿分娩[13]。新生儿体重<2 500 g定义为低出生体重，新生儿体重<1 500 g 定义为极低出生体重。先天异常是指排除染色体疾病导致的其他异常[14]。

三、统计学分析

利用SPSS 20.0 统计软件中的单因素方差分析对试验结果进行差异显著性检验。计量资料使用(均值±标准差)表示，对于正态或非正态分布资料分别采用两独立样本t检验；计数资料用率(%)表示，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般情况

本研究共纳入19 574个FET周期，根据胚胎冻存时长分为6组。女方取卵时平均年龄为(30.83±4.75)岁，移植时平均年龄为(31.06±4.75)岁。胚胎冻存时间为1～116个月。

各组的基础参数分布包括取卵年龄、移植年龄、BMI、决定移植日内膜厚度、不孕年限、平均移植胚胎数、解冻囊胚移植比例均有统计学差异(P<0.01)。其中≥49个月组取卵年龄最小、移植年龄最大(P<0.01)；37～48个月组和≥49个月组BMI显著低于其它组(P<0.01)，其他各组之间BMI无统计学差异(P>0.05)；7～12个月组平均移植胚胎数最多(P<0.05)；7～12个月组和13～24个月组决定移植日内膜厚度最低(P<0.01)，其他各组之间内膜厚度无统计学差异(P>0.05)；≥49个月组不孕年限最长(P<0.05)；解冻囊胚移植比例随着冻存时间的增加而降低，≥49个月组解冻囊胚移植比例最低(P<0.01)(表1)。

二、胚胎解冻后移植结局

1.FET周期妊娠结局：不同冻存时间组胚胎解冻后的胚胎复苏率、种植率、HCG阳性率、临床妊娠率、流产率均有显著差异(P<0.01)。1～6个月组胚胎复苏率、HCG阳性率和临床妊娠率均最高，而流产率最低(P<0.01)(表2)。

表1 不同冻存时长各组一般资料比较[(-±s)，n(%)]

表2 不同冻存时长胚胎的FET妊娠结局(%)

2.FET周期新生儿结局：不同冻存时长胚胎解冻移植后单卵双胎率、新生儿出生体重、出生性别比、畸形比例均无统计学差异(P>0.05)；25～36个月组低出生体重比例最高为12.50%(P=0.011)，7～12个月组极低出生体重比例最高为2.29%(P=0.011)(表3)。

表3 不同冻存时长胚胎的FET周期新生儿结局(%)

3.囊胚亚组FET周期妊娠结局：不同冻存时长囊胚解冻后复苏率、单卵双胎率均无统计学差异(P>0.05)。1～6个月组囊胚解冻后的种植率、HCG阳性率、临床妊娠率最高，而≥49个月组囊胚解冻后的种植率、HCG阳性率、临床妊娠率和流产率最低(表4)。

表4 不同冻存时长囊胚的FET妊娠结局(%)

讨 论

本文研究结果表明随着冷冻时间的延长，胚胎存活率显著降低。早期研究认为，慢速冷冻保存6～15个月后胚胎存活率下降，长期存储后妊娠率有降低的趋势[15]。但也有研究发现，低温保存时间对复苏后胚胎的质量、存活情况、植入能力和活产潜力的影响差异并不显著[16-17]。2016年针对786个卵裂期胚胎FET周期的研究发现，低温储存时间不影响复苏周期的临床妊娠率和活产率[18]。现在胚胎冷冻保存技术已经从慢速冷冻发展到常规使用玻璃化冷冻，仔细评估其对IVF和胚胎的潜在影响以及围产期结局具有重要意义。液氮低温贮存时间是否会影响胚胎复苏及其相关临床结局尚需要评估。随着胚胎存放在液氮中时间的增加，人们越来越担心胚胎长期低温储存的安全性。

本研究对在我中心行FET的19 574个周期进行研究，比较胚胎经历不同冻存时间后胚胎复苏率、临床妊娠率和新生儿情况。结果显示，1～6个月组胚胎复苏率最高，其他各组胚胎复苏率依次降低(P<0.01)。由于本研究纳入的周期包含卵裂期胚胎解冻移植和囊胚解冻移植。因此，本研究又进一步统计分析了不同冻存时间组囊胚解冻后胚胎复苏的情况，发现37～48个月组和≥49个月组解冻囊胚复苏率最高，但各组之间并无统计学差异(P>0.05)，并不会随冻存时间增加而影响胚胎复苏率，与肖亚玲等[19]观点一致。

本研究中各组临床妊娠率和流产率在不同冻存时间组均有差异。由于患者一般情况中取卵年龄、BMI和决定移植日内膜厚度均都有差异，所以并不能直接判断是否是玻璃化冷冻保存时长的差异导致了各组妊娠率和流产率的差异。本文中取卵年龄虽有差异，≥49个月组取卵年龄最小，冷冻保存时间最长，复苏率、种植率、临床妊娠率都不是最高；1～6个月组冷冻保存时间最短，复苏率、HCG阳性率、临床妊娠率都是最高的，取卵年龄却不是最小的，从侧面表明与取卵年龄无关。2020年文献结果显示取卵年龄、移植年龄和冷冻保存时长对妊娠率没有显著影响[19]。

本研究各组BMI有统计学差异，平均BMI为(22.37±2.91)kg/m2。Schliep等[20]报道肥胖对于IVF/ICSI治疗结局无显著负面影响，且没有降低患者妊娠率和活产率。Insogna等[21]研究发现超重和肥胖并不降低冻融囊胚移植周期患者的妊娠率、种植率以及活产率。本研究各组的平均BMI均在正常范围内，不会干扰冻存时间对妊娠率等结果的影响。FET所有患者采用自然周期、促排卵周期或人工周期方案准备子宫内膜，以创造最佳的子宫环境，并使用统一的标准化移植方法。虽然子宫内膜厚度有差异，但均在移植的容受窗内，最大限度地减少了可能的混淆因素。我中心2010年的一篇回顾性分析比较了1 372个FET周期的临床治疗结局，认为子宫内膜厚度并非评价子宫内膜容受性的可靠指标，不会影响妊娠结果[22]。2017年的研究报道认为内膜厚度≥6 mm即可达到较好的种植率和临床妊娠率，同时不增加流产率[23]。本文数据显示子宫内膜厚度平均为(9.66±1.70)mm，根据相关文献报道，并不会影响冻存时间对妊娠结果的影响。

本研究认为移植囊胚的临床妊娠率更高。有研究对解冻囊胚与卵裂期胚胎的移植进行比较，发现囊胚的妊娠率显著高于卵裂期胚胎[24-25]。自然生理状态下早期卵裂期胚胎应在输卵管中发育，到近囊胚期才进入子宫腔，复苏周期囊胚移植更符合生殖生理，并且降低了异位妊娠率[26]。本研究表明不同冻存时间组的单卵双胎率、新生儿出生体重、出生性别比、畸形胎儿比例等新生儿结局均无统计学差异。但新生儿低出生体重比例和极低出生体重比例，均在7～12个月时长组比重较大，有统计学差异(P<0.05)，这与2016年发表的一篇报道不一致[27]。由于影响新生儿结局的因素很多，需要进一步挖掘数据分析。在玻璃化过程中，胚胎暴露于冷冻保护剂并且在开放式玻璃化系统中直接与液氮接触，其中一个或多个环节暴露可能会改变早期胚胎发育并影响其植入和生长潜力。

据推测，玻璃化冷冻过程可能会对滋养层细胞产生损伤而影响随后胎盘的发育[28]。也可能是玻璃化冷冻和复苏过程中的环境变化和实验室处理导致表观遗传变化过于微妙，所以无法获得明确的证据来证实玻璃化冷冻过程对IVF和胚胎移植或围产期结局以及后代的发育和健康的明确影响。随着胚胎冷冻技术及其复苏技术的更新，也许会有更新的技术和方法出现。因此在临床工作中，对患者进行综合评估，掌握适当的移植时机，对提高患者的临床结局至关重要。

综上所述，本研究认为随着冷冻保存时间的延长，胚胎复苏率会下降。短期的保存(不大于6个月)可以获得较高的临床妊娠率。因此，如果条件允许，冷冻保存的胚胎应尽早进行胚胎复苏。但长期冷冻保存的胚胎，其出生婴儿的健康状况并未发现显著异常。本文数据提示冷冻保存时间对单卵双胎、初生儿体重、男女比例并无显著影响。但考虑胚胎冷冻保存过程中可能受到保存条件细微变化的影响，导致胚胎的遗传物质发生改变而致出生婴儿远期肿瘤等疾病发病率增高，为确保胚胎玻璃化冷冻保存和复苏的安全性，未来的研究应该评估婴儿的长期健康状况与玻璃化冷冻和长期低温保存的相关性。