UPLC-PDA法检测桉木预水解液中5-羟甲基糠醛

齐云赓 马明帅 郭怀泽 李海明

（辽宁省制浆造纸工程高校重点研究室，大连工业大学轻工与化学工程学院，辽宁大连，116034）

利用生物质精炼技术可将储量丰富、廉价、可再生的植物资源转化成生物质基的化学品、材料和燃料等，进而实现资源利用价值的最大化，促进人类社会的可持续发展［1］。热水预水解技术可破坏植物生物质的天然抗拒性［2］，提高酶及化学品的可及性［3］，是生物质精炼技术体系中一种以水作为唯一试剂、简单且成本低的重要前处理技术［4-6］。生物质在预水解过程中会产生很多种醛类和有机酸类物质［7］，己糖类物质会脱水生成5-羟甲基糠醛（5-HMF）［8］。5-HMF是一种重要的平台化合物，在合成石油类、高分子类、呋喃类产品以及精细化学品等方面的应用前景广泛［9］，且在食品、医药领域也有特殊的应用价值［10-11］。

目前，对于5-HMF的检测多采用高效液相色谱（HPLC）法［12-16］，其原理为样品首先随流动相泵入色谱柱，然后依次洗脱分离出来，最后通过光谱检测器，该检测方法存在耗时长的缺点，而且由于检测器的限制，只能提供单波长数据；此外，高效液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法可作为HPLC的补充，如可用于饮料中5-HMF的测定，然而此类方法检测时，样品需经过提取、净化、衍生化等较为繁琐的处理［17］。紫外-可见光分光光度计（UV-Vis）法也可以用于检测5-HMF［18-19］，但预水解液成分较复杂，其中的有机酸类物质和酸溶木质素等有紫外吸收的物质会降低检测的准确性。超高效液相色谱（UPLC）法的分离原理与HPLC一致，相较于以上传统方法，其效率更高，洗脱时间可缩短至HPLC的1/10［20］。二极管阵列检测器（PDA）采取多通道并行测量方式，具有速度快、噪声小、线性范围宽、精度高等特点，与色谱联用可提供3D数据［21］。

本研究以制浆造纸工业中广泛使用的桉木为原料进行热水预水解，并采用UPLC-PDA法检测桉木预水解液中的5-HMF，最后在此基础上对桉木热水预水解过程中5-HMF的生成规律进行阐述。

1 实验

1.1 实验材料及设备

实验用桉木片购自广西某地，经风干晾晒，装袋保存；5-HMF，纯度＞98%，美国Aladdin公司；乙腈，纯度＞99.9%，德国默克公司；超纯水，电阻率＞18.2 MΩ·cm。

超高效液相色谱仪（UPLC），ACQUITY UPLC HClass，美国Waters公司；M/K蒸煮锅，609-2-10型，美国M/K公司；超纯水发生器，EASY50，香港Heal Force公司；紫外-可见分光光度计，CARY 300Conc，美国VARIAN公司。

1.2 样品的制备

1.2.1预水解液的制备

将500 g绝干桉木片和水以液比1∶6加入到M/K蒸煮锅中，从室温升温到设定温度（即预水解温度），然后保温一段时间（即保温时间），反应结束后收集预水解液，置于4℃冰箱中冷藏保存待测。

1.2.25-HMF标准溶液的制备

以超纯水为溶剂，配置质量浓度为1.2637 mg/L的5-HMF标准母液，置于4℃冰箱中冷藏保存待测。对母液进行适当稀释，以获得一系列不同质量浓度的5-HMF标准溶液，用于定量标准曲线的绘制。

1.3 分析检测条件

色谱分析采用ACQUITY UPLC®BEH C18分析柱，乙腈/水（20∶80，V/V）为流动相，流速为0.2 mL/min，柱温为40℃，检测室温度为15℃，PDA eλ紫外检测器的扫描波长范围为190～400 nm。将预水解液离心处理后，取上层清液并稀释一定倍数，经0.22μm的水系过滤膜过滤后方可进行检测。

2 结果与讨论

2.1 谱图分析

预水解温度180℃、保温120 min条件下所得桉木预水解液的UV-Vis光谱图如图1所示。从图1可以看出，桉木预水解液在277 nm处出现特征吸收峰，在228和191 nm处亦出现吸收峰。

图1 180℃、120 min条件下所得桉木预水解液的UV-Vis光谱图

图2 5-HMF标准溶液的PDA光谱图

使用UPLC-PDA对5-HMF标准溶液进行表征，根据所得色谱图得知5-HMF的保留时间为1.520 min，与该保留时间对应的PDA光谱图如图2所示。从图2可以看出，5-HMF的特征吸收峰出现在283.55 nm处，另外在228.55和193.55 nm处也有吸收峰，但强度相对较低，该PDA光谱图与参考文献［22］中5-HMF标准溶液的UV-Vis光谱图完全吻合。

桉木预水解液成分复杂，含有小分子酸、糠醛、呋喃醛、酸溶木质素和糖类等物质，其中，糠醛、呋喃醛、酸溶木质素在280 nm附近均有吸收峰［23］，这些物质的存在会改变光谱吸收峰的位置和形状，降低UV-Vis法检测桉木预水解液中5-HMF的准确性。实验发现，桉木预水解液中的5-HMF的UPLC-PDA色谱图与5-HMF标准溶液的UPLC-PDA色谱图、5-HMF标准溶液的UV-Vis光谱图三者峰形和出峰位置一致，表明UPLC-PDA法通过色谱柱的洗脱分离可很好地解决桉木预水解液中各组分间的相互干扰问题，显著提高检测的准确性。

PDA检测器可测得不同保留时间的光谱图，而将特定保留时间下光谱图信号叠加之后，绘制叠加信号和保留时间的关系图，即可获得桉木预水解液的UPLC-PDA色谱图（见图3）。由图3可知，不同保留时间出现多个色谱峰，每个色谱峰对应不同的物质，再次证明桉木预水解液成分较为复杂，同时也说明多种物质已得到有效分离。

图3 180℃、120 min条件下所得桉木预水解液的UPLC-PDA色谱图

图4 UPLC-PDA法不同保留时间色谱峰对应的PDA光谱图

图4 为UPLC-PDA法不同保留时间下色谱峰的PDA光谱图。从图4可以看出，各组分的特征光谱吸收峰不尽相同，但绝大多数在283.55 nm处均有吸收（λ=283.55 nm处吸光度A均大于0），如果未经UPLC色谱柱分离，这些组分的存在必将对5-HMF的检测造成干扰。

2.2 线性关系和检出限

为了考察5-HMF标准溶液的质量浓度与对应峰面积的线性关系，将1.2637 mg/L的5-HMF标准母液稀释得到一系列不同质量浓度的5-HMF标准溶液，然后进行UPLC-PDA检测，得到不同质量浓度5-HMF标准溶液对应的峰面积，再根据5-HMF标准溶液质量浓度和峰面积，建立线性回归方程y=6721.9965x+49.0311，其中，线性范围为0.0158～3.1593 mg/L，相关系数（r2）为0.9998；其检出限按式（1）计算［24］。

式中，ρmin为检出限，μg/L；ρS为样品质量浓度，mg/L；hn为噪音峰高；h为样品峰高。经计算，5-HMF的检出限为3.883μg/L。

2.3 重现性实验

为了考察UPLC-PDA法检测5-HMF的重现性，将质量浓度为1.2637 mg/L的5-HMF标准母液进行连续进样5次重复检测，测得的质量浓度分别为1.2359、1.2400、1.2382、1.2435和1.2393 mg/L，计算得出5次检测结果的平均值（X）为1.2393 mg/L和相对标准偏差（RSD）为0.2%。可见，UPLC-PDA法的重现性较好。

2.4 5-HMF回收率测试

将1.2637 mg/L的5-HMF标准母液加入到预水解温度180℃、保温时间120 min条件下所得的桉木预水解液中，以进行5-HMF回收率的实验，进而考察UPLC-PDA法的检测准确性。5-HMF加标回收率（R，%）按式（2）计算。

式中，ρ1表示所加入5-HMF标准母液的质量浓度，mg/L；ρ2表示桉木预水解液中5-HMF的质量浓度，mg/L；ρ3表示加标后所测得的5-HMF质量浓度，mg/L。ρ1、ρ2和ρ3分别为1.2637、2.5284、3.8573 mg/L，经计算得到5-HMF加标回收率为105.2%，说明UPLC-PDA法检测的准确性较高。

2.5 桉木预水解过程5-HMF的生成规律

桉木中含有半乳糖基、甘露糖基和葡萄糖基等己糖类的糖基，其中半乳糖基含量2.54%（以半乳糖表示），甘露糖基含量4.90%（以甘露糖表示），葡萄糖基含量46.24%（以葡萄糖表示）。在桉木预水解过程中，半乳糖最先溶出，其次为甘露糖，最后为葡萄糖；在一定条件下，这些己糖会发生脱水反应生成5-HMF［25］，因此实时监控桉木预水解液中5-HMF的含量可辅助判断预水解过程中纤维素的降解程度，同时为分离和利用5-HMF提供指导。利用UPLC-PDA法对不同预水解条件下所得桉木预水解液中5-HMF进行定量分析，结果如图5所示。

图5 不同预水解条件下所得桉木预水解液中5-HMF质量浓度的变化规律

由图5可以看出，预水解温度和保温时间均对5-HMF生成的影响显著。当保温时间为30 min时，随着预水解温度的提升，桉木预水解液中的5-HMF从无到有，并且生成量逐渐增多。预水解温度不高于170℃时，存在保温时间效应（即随着保温时间的延长，桉木预水解液中5-HMF的含量逐渐增加），且随着预水解温度的提升，保温时间效应增强。预水解温度为180℃时，总体上仍然存在保温时间效应，但是保温90 min时，桉木预水解液中5-HMF的含量略有下降，造成这种现象的原因可能是60 min之前，随着保温时间的延长，己糖脱水生成5-HMF的速度加快，此过程中桉木预水解液pH值逐渐下降，保温时间延长至90 min时，由于此时体系的pH值、液相成分的比例以及固相孔隙结构等因素可能处于一种临界状态，使得5-HMF不再稳定，进一步发生降解生成乙酰丙酸、甲酸［26］或碳微球［27］，导致5-HMF的分解速率高于生成速率，因而体系中其含量略有下降，后期随着保温时间的进一步延长，固相孔隙结构、液相成分和pH值发生变化，利于己糖脱水生成5-HMF，最终表现为保温时间120 min时5-HMF含量进一步增加。

3 结论

采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UPLCPDA）法对桉木热水预水解液中5-羟甲基糠醛（5-HMF）进行检测，色谱条件如下：采用BEH C18分析柱，乙腈/水（20∶80，V/V）为流动相，流速为0.2 mL/min，柱温为40℃；采用PDA检测器，扫描范围为190～400 nm，定量波长为283.55 nm。5-HMF质量浓度与峰面积的线性回归方程y=6721.9965x+49.0311，线性范围为0.0158～3.1593 mg/L，相关系数为0.9998，检出限为3.883μg/L，重现检测相对标准偏差为0.2%，加标回收率为105.2%。该方法具有稳定性高、分析速度快、线性相关性和重现性良好的特点，为快速分析植物生物质中的5-HMF提供了一定的理论依据。通过对桉木热水预水解液中5-HMF的准确定量分析发现，保温时间和预水解温度是影响桉木预水解液中5-HMF生成的2个重要因素。在预水解温度足够高和保温时间足够长的条件下，5-HMF开始生成，随着保温时间的持续延长和预水解温度的升高，桉木热水预水解液中的5-HMF含量总体呈上升趋势，且随着预水解温度的升高，保温时间效应增强，这对调控预水解过程中纤维素降解形成葡萄糖及其进一步脱水形成5-HMF意义重大。