正交实验法优化郁金香总生物碱提取工艺

葛碧琛 陈小举 蒋慧慧

摘 要：采用醇提取法优化郁金香中总生物碱提取工艺。在单因素实验的基础上，以提取溶剂、液固比（液体体积与固体质量的比值）、提取时间为影响因素，郁金香总生物碱提取率为评价指标，通过正交实验优化提取工艺。结果表明，郁金香总生物碱的最佳提取工艺条件为：提取溶剂为70%乙醇溶液，液固比为40，提取时间为6h，此工艺条件下总生物碱提取率为（1.869±0.03）%。该方法简单快速，稳定高效，可用于醇提郁金香總生物碱实验。

关键词：郁金香;总生物碱;正交实验;提取工艺

中图分类号：O69;R284.2  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）09-0031-05

1 前言

郁金香（Tulipa gesneriana L.）是百合科郁金香属的多年生草本植物，具球茎。由于其花卉刚劲挺拔，叶色素雅秀丽，被誉为花中皇后，是伊朗、荷兰、匈牙利等国的国花[1]。经过园艺家们长期的杂交栽培，全世界已拥有八千多个品种，其中大约有150种较为常见。如今郁金香已在世界各个角落普遍种植，中国各地庭园中也多有栽培。由于郁金香观赏价值高，且价格昂贵，国内外学者主要对郁金香的栽培、生长发育等进行了系统的研究，如左岩[2]阐述了温室郁金香优化栽培技术;王吉福[3]主要针对高寒地区郁金香露地栽培技术进行了研究;Sun Yuan[4]等主要考察了立体栽培对郁金香光合特性和生长的影响;Derbyshire[5]研究了在南非的水培系统中郁金香栽培的营养需求。

目前鲜有人对郁金香的药用价值进行深入研究。在古代的草药书籍中，对于郁金香药用价值只在很少的参考文献中描述。《本草拾遗》中有如下记载：主一切臭，除心腹间恶气鬼疰，入诸香药用之[6]。《新疆药用植物志·第二册》（1979版）记载伊犁郁金香的鳞茎有清热、解毒、散结和化瘀功效，可治咽喉肿痛等症状[7]。国内学者对郁金香的药用价值研究也十分有限。许国英等[8]对新疆采集到的7种郁金香进行成分分析，研究结果表明其中6种郁金香都含有秋水仙碱以及其他种类的生物碱。夏提古丽·阿不利孜[9]采用系统预试法对郁金香可能所含的化学成分进行预实验，研究结果表明郁金香中含有多种天然活性成分，且地上与地下部分所含成分有所不同。毛科科[10]等选用荷兰狂诗人郁金香为原料，采用HD法水上蒸馏提取纯露，研究结果表明纯露中含有糖类、氨基酸类和黄酮类化合物。

由此可见，郁金香同时具备较好的经济价值和药用价值。本实验以郁金香为研究对象，选取郁金香地上部分进行生物碱定性鉴别，并首次以总生物碱含量为指标，采用单因素分析，对提取溶剂浓度、液固比、提取时间这三个因素对郁金香总生物碱提取率的影响进行考察，应用正交实验法优化提取方案，得到最佳的提取工艺参数。为更全面、实用、深入地研究、开发和利用郁金香资源提供了理论依据。

2 实验部分

2.1 实验试剂和仪器

新鲜郁金香，2018年4月采购自安徽省合肥市（郁金香产地为云南昆明）;秋水仙碱对照品，中国食品药品检定研究院批号：101176-201202;乙醇、石油醚、硅钨酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产;碘化铋钾试剂、碘化汞钾试剂，实验室自制。

XY1000-ZL型电子天平（常州幸运电子设备有限公司）;DHG-9070AE型电热恒温鼓风干燥箱（州普天仪器制造有限公司）;HH-W600型数显三用恒温水箱（荣华仪器制造有限公司）;SHZ-D Ⅲ型循环水真空泵（上海鹏奕仪器有限公司）;DF-101S型集热式加热搅拌器（常州普天仪器制造有限公司）;JK-500DB型数控超声清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）;TDZ5-WS型离心机（湖南平凡科技有限公司）;UV-5100型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 郁金香预处理及生物碱的提取与鉴定

将郁金香洗净，对其茎、叶、花瓣、花蕊分别进行60℃干燥处理。然后将干燥后的郁金香研磨，过4号筛，得郁金香不同部位粉末。

分别称取郁金香不同部位粉末1.5g于烧瓶中，加入80%乙醇30mL，60℃水浴回流3h，连续三次过滤提取液，10mL石油醚脱色两次，得提取液。

取不同部位的提取液于试管中，分别滴入硅钨酸、碘化汞钾和碘化铋钾试液，观察实验现象，鉴别郁金香不同部位是否含有生物碱。

2.2.2 对照品及供试品溶液的配制

对照品溶液的配制：精密称取秋水仙碱对照品100mg，用乙醇定容于100mL容量瓶中，得浓度为1mg/mL的对照品母液。

供试品溶液的配制：精密称取郁金香粉末（过4号筛）1.5g于烧瓶中，加入80%乙醇30mL，60℃水浴回流3h，连续三次过滤提取液，10mL石油醚脱色两次，得到的提取液浓缩干燥并称重。

取浓缩提取物0.1g，10mL乙醇复溶，超声波溶解10min，高速离心机离心10min，取上清液1mL于10mL容量瓶中定容至刻度，再从中取1mL于5mL容量瓶中定容至刻度，得浓度为0.2mg/mL供试品溶液，可进行生物碱定性鉴别试验。

2.2.3 最大吸收波长的确定

精密吸取各相同体积的对照品溶液、供试品溶液，加入无水乙醇，混匀，设置扫描波段为200nm～500nm，扫描波长间隔为1nm，置于紫外分光度仪中进行全波长扫描，确定秋水仙碱的最大吸收波长。

经过波长扫描结果显示生物碱在243nm和352nm处均有明显的吸收峰，其中243nm处为最大吸收峰，由此可确定总生物碱的吸收波长为243nm。

2.2.4 标准曲线的绘制

精密量取0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.25mL对照品溶液，分别定溶于10mL容量瓶中。以秋水仙碱对照品溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并建立线性回归，得到回归方程y=73.472x+0.002，R=0.9999。结果表明秋水仙碱在5-12.5μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.5 郁金香总生物碱的提取与测定

称取一定量的郁金香粉末，在不同的提取溶剂、料液比、时间下进行提取，连续三次过滤提取液，石油醚脱色两次，得到的提取液浓缩干燥并称重。取0.1g浓缩提取物，接下来的操作同2.2.2中供试品的配制方法，每个试样平行测量三次，取吸光度平均值，根据回归方程，按照以下公式计算郁金香总生物碱提取率：

y/%=×100

式中：y為生物碱得率，单位%;ρ为提取液中生物碱的质量浓度，单位μg/mL;V为提取液总体积，单位mL;m1为总提取浓缩物质量，单位mg;m2为测量时称取的提取浓缩物质量，单位mg;m3为郁金香粉末质量，单位mg;103为μg换算成mg。

2.2.6 单因素实验

以郁金香中总生物碱提取率为评价指标，分别考察提取溶剂浓度（50%、60%、70%、80%、90%，固定液固比为20，60℃水浴回流3h）、液固比（10、20、30、40、50，固定提取浓度为80%乙醇，60℃水浴回流3h）、提取时间（1.5、3、4.5、6、7.5h，固定提取溶剂为80%乙醇，液固比为20，60℃水浴回流）3个因素对郁金香总生物碱提取率的影响。每个单因素进行3次平行试验。

2.2.7 正交实验设计

在单因素实验的基础上，选取提取溶剂（A）、液固比（B）、提取时间（C）为考察因素，以总生物碱提取率为考察指标，采用L9（33）正交表，通过SPSS设计实验，筛选最佳提取工艺条件，因素和水平设计见表1。

2.2.8 验证实验

为了进一步考察优选工艺的可靠性和稳定性，准确称取郁金香粉末3份，每份1.5g，在上述确定的最优工艺条件下进行3次平行验证实验，计算总生物碱提取率。

3 结果与分析

3.1 郁金香生物碱的提取与鉴定结果

取郁金香地上部位花、茎、叶、花蕊的提取液于试管中，分别滴入硅钨酸、碘化汞钾和碘化铋钾试液，观察实验现象，鉴别郁金香不同部位是否含有生物碱。结果如表2所示。由表2中可以看出，郁金香的不同部位中，茎、叶、花中均含有生物碱，而花蕊中未检测到生物碱成分。因此，为方便后续实验的进行可将三个花、茎、叶三个部位混合制成郁金香粉末，不影响总生物碱含量的测定。

3.2 单因素实验结果与分析

3.2.1 提取溶剂对总生物碱提取率的影响

随着乙醇浓度的增加总生物碱提取率增加。如图1所示，提取溶液浓度为80%时达到最高，继续增加乙醇浓度，总生物碱提取率反而降低，因此选择乙醇浓度70%、80%、90%作为正交试验设计的三水平。

3.2.2 液固比对总生物碱提取率的影响

随着提取溶剂用量的增加，总生物碱提取率随之增加，如图2所示，当液固比为20-40范围内，增大提取溶剂用量对总生物碱提取率影响不明显，呈现缓慢的增长，继续增加提取溶剂用量总生物碱提取率反而下降，因此选择液固比20、30、40作为正交试验设计的三水平。

3.2.3 提取时间对总生物碱提取率的影响

随着提取时间的增加，总生物碱提取率也随之增加，如图3所示，提取时间为4.5h时总生物碱提取率达到最高，随着提取时间的延长，总生物碱提取率逐渐下降，因此选择提取时间3.0、4.5、6h作为正交试验设计的三水平。

3.3 正交实验结果与分析

三因素三水平正交实验结果和方差分析见表3、4所示。由表3中的R值可知，在所考察的三种因素中，对总生物碱提取率影响大小的顺序为：（B）>（C）>（A），即液固比的影响最大，其次是提取时间、提取溶剂，其中液固比对总生物碱提取率有显著影响。通过k值可判断出最佳的提取条件是：A1B3C3，即采用70%乙醇溶液，液固比为40，提取6h。

3.4 验证实验

取郁金香粉末3份，每份1.5g按优选出来的最优工艺进行提取，即采用70%乙醇溶液，液固比为40，提取6h。由验证结果可知，按最佳工艺条件总生物碱提取率为（1.869±0.03）%，相对标准偏差（RSD）为1.60%，结果与理论最佳工艺总生物碱提取率相近且高于正交实验其他组合，说明工艺条件稳定可行，结果见表5。

4 结论

本实验以郁金香为原料，通过单因素实验确定提取溶剂、液固比、提取时间对总生物碱提取率的影响，通过正交试验优化分析得到郁金香总生物碱的最佳提取工艺：提取溶剂为70%乙醇溶液，液固比为40，提取时间为6h。经过验证，此条件下总生物碱提取率为（1.869±0.03）%，与理论最佳工艺总生物碱提取率接近，说明该优化工艺有可行性。

本课题组前期预实验对郁金香不同部位中的各种天然活性物进行提取并鉴别，研究结果显示，郁金香中含有黄酮化合物、生物碱、萜类化合物、甾体化合物、蛋白质和糖类等天然活性成分，且郁金香各部位所含的天然活性成分种类无明显差别，但其含量有所差别，尤其是生物碱成分在沉淀反应中现象显著。生物碱是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质。生物碱大多数有复杂的环状结构，氮素多存在于在环内，有显著的生物活性，是中草药中一种重要的有效成分。按照生物碱的基本结构，可大致分成60类。其中大多数有药用价值，如附子中的乌头碱具有强心、抗炎、镇痛的功效[11-13];麻黄碱、伪麻黄碱等生物碱具有缓解支气管平滑肌痉挛的作用[14];长春新碱具有抗癌作用[15]。当前鲜有关于郁金香中生物碱的相关研究，本课题为郁金香药用价值的进一步研究、开发以及郁金香中总生物碱提取工艺的优化提供科学依据。

目前，生物碱的提取工艺主要有溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法以及其他方法[16-18]。本研究采用实验室最常用的醇提取法。该法根据相似相容原理能够尽可能多地将郁金香中的生物碱成分溶出。但研究仍有一些不足之处，如未考虑到提取温度对总生物碱的影响，提取时间长，提取物中杂质多，提取率不太高等。故今后应拓宽研究思路，尝试其他提取工艺技术或多种工艺协同提取，不断创新郁金香总生物碱提取工艺技术，努力提高总生物碱提取率。同时，应开展郁金香生物碱生物活性研究，如体外抗氧化活性、抑菌活性等，为郁金香中生物碱的合理应用提供理论基础和有力的技术支持，使郁金香生物碱的药用价值在促进人类健康中发挥积极作用。

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