荞麦叶大百合组织培养初步研究

李婷婷 李娜 李波 汪小飞 万志兵

摘 要：目的：荞麦叶大百合长期处于野生状态，不适宜连续分球、扦插等繁殖方式。采用组织培养进行繁殖，探究启动培养、诱导愈伤组织及不定芽的最佳培养基，以期建立荞麦叶大百合快速繁殖体系。方法：所有实验采用MS基本培养基。在外植体灭菌实验中，采用75%乙醇与0.1%升汞灭菌，对比污染率与诱导率筛选最适消毒方式;鳞片启动培养实验中，附加不同浓度的6-BA与NAA，计算并对比诱导出愈伤组织或不定芽的诱导率;诱导愈伤组织实验中，采取不同浓度的2，4-D与相同浓度的6-BA（0.5mg/L）和NAA（0.1mg/L）进行配比来诱导愈伤组织，并比较诱导率;在诱导不定芽分化的实验中，不同浓度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0mg/L）与NAA（0.1mg/L）诱导愈伤组织分化不定芽。结果：以75%乙醇50s，0.1%升汞8min，对鳞片的灭菌作用最好;MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA最适于鳞片的启动培养，诱导率高达90.67%;MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 2，4-D的培养基对叶片愈伤组织的诱导效果最佳，诱导率为49.43%;MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA时，愈伤组织分化的不定芽数量最多，诱导率达到78.81%。

关键词：荞麦叶大百合;组织培养;鳞片

中图分类号：Q943.1  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）09-0022-05

引言

荞麦叶大百合（Cardiocrinum cathayanum），多年生粗壮草本植物，属百合科大百合属，多处于野生状态，为中国特有[1，2]，在我国江苏、浙江、安徽、江西、湖南、湖北等地均有分布，生长在海拔600～1050m的山坡、谷地疏林和灌木丛中，是华中华东分布的特有种[3，4]。大百合属植株高大，姿态挺拔优美，春季萌发基生叶莲座状，叶片碧绿油亮，夏季总状花序顶生，花大洁白而美，可做切花、盆花和花境植物等，具有较高的观赏价值[5]。大百合属基生叶的叶柄基部膨大形成鳞茎，富含多种营养物质，鳞茎研磨后可取食，具有保健和营养价值[6]。百合属植物具有药用功能，果实入药[7]，已研制出具有清肺止咳、解毒、散瘀功效的药用百合七，作为一味中药广泛运用[8]。

百合科植物通常通过扦插、分球或分株进行繁殖，荞麦叶大百合为野生，繁殖多采用种子繁殖和分球繁殖，种子发芽率极低，而分球繁殖具有繁殖率低，不能满足规模化生产的需要，而且这些繁殖方式容易造成百合品质和优良性状的退化，使荞麦叶大百合的价值降低，在一定程度上影响野生花卉荞麦叶大百合的推广和应用[9，10]。

解决荞麦叶大百合繁殖问题较为行之有效的方法是进行组织培养，组织培养能在短期内大量快速繁殖，是有效的商业化、产业化生产的途径。本实验对荞麦叶大百合的组织培养进行初步研究。而鳞茎一般作为百合科植物组织培养的外植体[11，12]，本实验同样采用鳞茎作为启动培养的外植体，但由于鳞茎长期生长于地下，具有大量的真菌和细菌，很难做到完全消毒灭菌，总体上污染率偏高。本实验通过75%乙醇与0.1%升汞的处理，筛选污染率较小的消毒方法为后续实验做准备。

采用组织培养的方法繁殖大百合，可以加快繁殖速度，荞麦叶大百合虽一直处于野生状态，但目前对其离体培养已有了一定的研究，并且得到了一些较理想的方法[11-13]。以往在百合科植物进行组织培养的研究中，肖玉菲[13]等人在进行大百合鳞茎诱导出芽的实验中，采用不同浓度梯度的6-BA和NAA处理大百合鳞茎，观察接种后是否产生愈伤组织，或产生不定芽。结果表明，MS+5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA更有利于誘导鳞茎产生愈伤组织，作为启动培养基;马生军[13]等人以不同浓度的6-BA和NAA进行配比诱导不定芽分化，其中MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA为最佳诱导不定芽培养基。

本实验首先以鳞茎为外植体，以MS为基本培养基，附加不同浓度6-BA与NAA，通过对比诱导率筛选最适启动培养基;在诱导愈伤组织的实验中，在MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA培养基的基础上附加不同浓度的2，4-D，对比愈伤组织的状态与诱导率选出最适愈伤组织诱导培养基;成功诱导愈伤组织后，不同浓度的6-BA与0.1mg/L NAA配比，附加于MS基本培养基中诱导不定芽的分化，并将在培养过程中生根的组培苗移栽至温室中，以期达到后续可持续利用的目的。同时，为荞麦叶大百合的人工培养和大量繁殖提供理论依据，更好地开发利用荞麦叶大百合资源。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

荞麦叶大百合的外植体为鳞茎，取自安徽省黄山风景区温泉附近的荞麦叶大百合野生群落，取回后立刻对其进行假植。

1.2 培养基及培养环境

1.2.1 培养基

实验以MS为基本培养基，不同的培养阶段设置不同激素浓度组合。

1.2.2 培养环境

培养室温度为25±2℃，空气相对湿度为70%，日光灯光源，光照强1000lx，光照12h/d。

1.3 实验方法

1.3.1 外植体的预处理

取生长健壮、无病虫害的荞麦叶大百合鳞茎作为外植体，清洗表面泥污，小心剥离鳞茎，将中层内层的鳞片在洗衣粉溶液中浸泡5min，再用自来水流水冲洗2h。

1.3.2 接种方法

接种前将鳞片切成0.5cm×1cm的小块，用无菌水冲洗掉流出的组织液，在5mg/ml的抗坏血酸（Vc）溶液中浸泡5min备用。将小鳞片腹面向上接种到培养基上。每瓶培养基接种1个，每个处理30瓶，3次重复。

1.4 实验设计

1.4.1 不同消毒方式对鳞片启动培养的影响

采用75%的乙醇、0.1%的升汞和吐温-80对鳞片进行4个时间梯度处理，不同消毒时间处理方法如表1所示。将鳞片接种在MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NA蔗糖30g+琼脂6.4g的培养基中，培养20天后统计污染率和诱导率。

1.4.2 不同激素配比对鳞片启动培养的影响

采用最佳的消毒方式处理鳞片后，分别接种到不同的诱导培养基中，具体激素配比如表2所示，培养30天后统计诱导率。

1.4.3 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

以鳞片启动培养诱导出的健壮、无褐化现象的叶片为材料，分别接种到相应的愈伤组织诱导培养基中，激素配比如表3所示，培养30天后统计结果。

1.4.4 不同激素配比对不定芽诱导的影响

选择生长状况良好、嫩绿且结构紧密的愈伤组织为接种材料，切成0.5cm×0.5cm的小块，分别转接到不同处理的培养基上，培养30天后统计分化情况。

1.4.5 组培苗移栽

在上述实验过程中会诱导出根，将生根且生长良好的组培苗移栽至温室的基质中，移栽前喷洒一定浓度的多菌灵进行基质杀菌消毒，并在移栽后定期喷洒营养液。

1.5 数据统计与分析

接种后每隔10d进行一次观察，记录产生愈伤组织及不定芽的数量，以及组培苗生长状况。

数据统计使用Excel 2010进行，数据处理使用SPSS 20.0软件的ANOVA過程对各处理进行差异性的检验和Duncan法对结果进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式对启动培养的影响

在组织培养的过程中，出现污染的情况是很常见的，污染率的高低是植物组织培养成功的关键。本实验通过用75%乙醇与0.1%升汞处理外植体的时间长短不同，来探究消毒时间对污染率与诱导率的影响。

由表1可以看出，每种消毒方法都对污染率产生一定遏制作用，随着消毒时间的延长，污染率逐渐降低。A组处理（75%乙醇30s，0.1%升汞6min）下的外植体污染率最高，达到83.64%，显著高于其他三组处理，且A组处理最先出现污染情况;同时A组处理下的诱导率最低，为24.33%，明显低于其他三组处理下的诱导率，显然A组消毒处理不适宜荞麦叶大百合启动培养。同样，B组处理（75%乙醇40s，0.1%升汞7min）下外植体污染率为57.65%，诱导率为34.25%，二者均次于C、D两组处理。

D组处理（75%乙醇60s，0.1%升汞9min）污染率最小，为42.35%，并且明显低于另三组处理，但该处理下的诱导率为46.28%，显著低于C组处理75%乙醇50s，0.1%升汞8min下的诱导率52.67%。猜测可能是由于升汞处理的时间过长，使鳞片的诱导率降低。

上述分析表明，本实验中C组消毒处理的效果最好，后续接种实验均采用该消毒方法。

2.2 鳞片启动培养的诱导

本实验以MS为基本培养基，附加不同浓度6-BA和NAA配制培养基接种荞麦叶大百合鳞片，进行初代启动培养，通过对比诱导率筛选最适启动培养基，结果见表2。接种后的鳞片在培养的第四天，鳞片体积显著增大，颜色逐渐变绿，部分鳞片出现红紫色的条纹。有些鳞片经诱导后直接形成的绿色的大型叶片，叶片在培养的过程中可形成愈伤组织，甚至可以分化出淡绿色的不定芽。

从表2可以看出，当6-BA浓度为0.5mg/L时，诱导率随着NAA的浓度增加而降低，且四组激素配比处理下的诱导率均较低。其中，5组处理（MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA）下的诱导率最高，为60.00%，相同浓度的6-BA处理下，当NAA为0.1mg/L时诱导率明显高于0.5mg/L的处理结果。可得出结论：NAA在低浓度（0.1mg/L）条件下对荞麦叶大百合鳞片启动培养效果最佳。

当NAA浓度为0.1mg/L时，随着6-BA浓度的增加，诱导率逐渐增高，除1组处理（MS+0.1mg/L NAA）诱导率较低为51.62%外，其他三组处理诱导率均较高。其中，4组处理（MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA）下，诱导率最高为90.67%，且显著高于其他激素配比处理，相对于1组处理诱导率提高了39.05%，而在本次实验所有处理组中，明显高于8组处理，其诱导率为42.33%，提高了48.34%;同时，诱导率仅次于4组处理的3组处理，其诱导率为75.33%，相对于4组处理，显著降低了15.34%。

实验表明细胞分裂素6-BA对鳞片的启动培养有促进作用，而高浓度的生长素NAA对鳞茎的诱导有抑制作用。由上述分析得出，本实验中培养基中的激素配比为MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA时，鳞片的启动效果最好。

2.3 愈伤组织的诱导

由2.2可知，MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA诱导率最高。本实验将不同浓度梯度的2，4-D（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L）和0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA配制愈伤组织诱导培养基接种叶片。叶片在接种后，逐渐出现淡绿色、半透明的疏松组织，随着培养时间的延长，慢慢变为白色的、结构紧密的愈伤组织，激素配比对诱导率的影响差异见表3。

由表3可知，2，4-D对叶片愈伤组织诱导率有显著影响，且有助于提高叶片愈伤的诱导率。随着2，4-D的浓度的增加，诱导率递增。当2，4-D浓度为2.0mg/L时，诱导率最高，达到49.43%，与浓度为1.5mg/L时诱导率无明显差别，但显著高于剩余两组处理。1组处理，当2，4-D浓度为0.5时，诱导率最低，为41.67%，相对4组处理，显著降低了7.76%。

综上所述，MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA+2.0mg/L是用于诱导愈伤组织的最佳培养基。

2.4 不定芽的分化

愈伤组织转接到相应的诱导培养基后，其体积不断地增大，同时形成2-4个淡绿色的小突起，继而伸长形成不定芽。本实验通过不同浓度的6-BA与0.1mg/L的NAA配比处理愈伤组织诱导不定芽，探究不同激素配比对不定芽诱导率的影响，结果见表4。

由表4分析可知，6-BA对愈伤组织对不定芽的诱导有促进作用，当NAA浓度为0.1mg/L时，不定芽的诱导率随着6-BA浓度的增加而显著增加。4组处理（2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）下不定芽的诱导率最高，达到78.81%，且显著高于另外三组处理，相对于1组处理（0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L）诱导率为29.71%，显著提高了29.1%。而2组处理（1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）与3组处理（1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）下的不定芽诱导率分别为34.56%与54.55%，显著高于1组处理，但明显低于4组处理。

综上所述，4组处理（2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）最适宜诱导愈伤组织分化不定芽。

3 结论与讨论

植物根际存在大量微生物，因而在以荞麦叶大百合鳞茎作为外植体时，接种前灭菌的方式与时间至关重要，灭菌剂浓度过大或灭菌时间过长都容易使外植体受到伤害，浓度过小或过短，灭菌不彻底，而达不到灭菌的最终效果。本研究中75%乙醇消毒50s、0.1%升汞消毒8min鳞片的启动效果好，成活率高，且污染率相对较低;而75%乙醇消毒60s、0.1%升汞消毒9min時虽然污染率低，但鳞片褐化死亡现象严重，影响到了鳞片的成活率。李国瑞[14]在紫薇灭菌时间的研究与本研究结论一致，较嫩的外植体应当适当减少灭菌时间。

在植物组织培养过程中，添加适当的外源激素是成功诱导愈伤组织的关键因素[15]。在荞麦叶大百合的组织培养实验中，多数研究者采用6-BA与NAA，本实验采用2，4-D与6-BA、NAA相互配比诱导愈伤组织，且结果表明，2，4-D对荞麦叶大百合愈伤组织的诱导有明显的促进作用。

任江萍等在大麦幼胚立体培养条件的建立中也提到，不同浓度2，4-D对大麦愈伤组织的诱导存在较大差异[16]。本研究中荞麦叶大百合叶片愈伤组织的诱导实验中，2，4-D能够促进叶片的出愈率.2，4-D浓度为2.0mg/L时，诱导效果最佳，与任江萍的研究相似，她认为2，4-D的浓度在1-2 mg/L时，愈伤诱导率较高[15]。

植物生长发育过程与植物的内源和外源激素种类、含量及配比等有密切关系。在诱导愈伤组织产生不定芽的实验中，可以看出6-BA对不定芽的诱导有较明显的影响，在马生军[12]等人的实验中，NAA浓度不变时，随着6-BA浓度的增加呈现先增加后下降的趋势，该结果与本实验结果相同，6-BA2.0mg/L与NAA0.1mg/L配比时，分化的不定芽数量多，生长速度快。

由于荞麦叶大百合长年生长于野生状态，移栽后需要多加管理，并于后期喷洒一定量的营养液使移栽后的组培面生长良好，为其后续利用提供更多材料，以满足市场需求。

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