响应面法优化结香花总黄酮提取工艺及其抗氧化活性

张意笠,程汝滨,黄 真,余水生,周樟平,钟晓明,*

(1.浙江中医药大学药学院,浙江杭州 310053;2.浙江九龙山国家级自然保护区管理局,浙江遂昌 323300;3.遂昌县科技局,浙江遂昌 323300)

结香(EdgeworthiachrysanthaLindl.)为瑞香科结香属落叶灌木,主要分布于长江流域以南以及河南、陕西等地[1]。据《药用植物辞典》记载[2],结香的花蕾、根、茎皮均可入药。结香花为结香的花蕾,别名打结花、金腰袋、梦冬花等[1],具有养阴、安神、明目、祛障翳等功效。研究表明,结香花含有丰富的香豆素类、黄酮类、有机酸和甾体等化合物[3-5]。

近年来,随着人们对“绿色消费”、“回归自然”理念的重视,大众对含有植物提取物产品的认可度不断提升,天然植物提取物的商业价值越来越高,国际上对植物提取物的需求量也越来越大[6-7]。黄酮类化合物作为一种多羟基酚类物质的次生代谢产物,普遍存在于自然界中。植物黄酮类化合物具有广泛的药理活性,已在许多行业得到广泛应用[8-9]。目前提取结香花中黄酮类物质的工艺主要有回流提取法、超声波提取法、超临界流体萃取法[10]等。徐玲[11]通过比较回流提取法、超声波提取法和闪式提取法三种方法,结果显示回流提取法操作简单且得率较高,通过正交试验得到最优工艺下的黄酮得率为7.2 mg·g-1。但响应面法优化结香花总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究未见报道。

因此,为促进结香花资源的开发利用和深入研究,本研究以结香花为原料,在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken法优化结香花中总黄酮的提取工艺,并从其清除DPPH自由基、ABTS自由基的能力初步研究结香花总黄酮抗氧化活性,旨在为更好地开发利用结香花资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

结香花 采自浙江省丽水市遂昌县高坪镇,经浙江中医药大学药学院中药资源研究所陈孔荣副教授鉴定为瑞香科结香属结香EdgeworthiachrysanthaLindl的花蕾;芦丁对照品 上海源叶生物科技有限公司,批号:T27F10Z81699;1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 上海源叶生物科技有限公司,批号:W27F10E81251;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 酷尔化学,批号:54C1201V;L-抗坏血酸(VC) Sigma,批号:WXBB4747V;无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、过硫酸钾 国药集团化学试剂有限公司。

DZF数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司;AL104电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海荣亚生化仪器厂;HH-S数显恒温水浴锅 上海宜昌仪器纱筛厂;UV-1800型紫外分光光度计 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 结香花总黄酮的提取 结香花在60 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重,粉碎,过50目筛,得样品粉末。称取1.00 g,在一定的乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间的条件下进行回流提取,然后将得到的提取液抽滤,定容至50 mL容量瓶,备用。

1.2.2 总黄酮的测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线的绘制 参考文献[12]并加以修改,精密称取芦丁对照品25.0 mg,加70%乙醇定容至25 mL容量瓶,摇匀,即得1.0 mg·mL-1对照品溶液。精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL对照品溶液于25 mL比色管中,各加水至6 mL,分别加入5% NaNO2溶液1 mL,混匀后静置6 min,加10% Al(NO3)3溶液1 mL,混匀后静置6 min,再加4% NaOH溶液10 mL,加水至刻度,混匀,静置15 min,于510 nm波长处测定吸光度(A)。以吸光度(A)对芦丁质量浓度(X)进行回归,得到回归方程为A=0.2738X-0.0032(R2=0.9993)在0.02～0.12 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

1.2.2.2 结香花总黄酮的测定 准确量取样品溶液4.0 mL于25 mL比色管中,按照“1.2.2.1”中所述方法进行操作,按下式计算总黄酮得率。

式中,Y为总黄酮得率(mg·g-1),C为结香花总黄酮的质量浓度(mg·mL-1),V为测量总黄酮提取液体积(mL),N为稀释倍数,M为称量的结香花干品质量(mg)。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 固定液料比20∶1,提取温度60 ℃,提取时间60 min,考察乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%对总黄酮得率的影响。

1.2.3.2 液料比对总黄酮得率的影响 固定乙醇浓度80%,提取温度60 ℃,提取时间60 min,考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1对总黄酮得率的影响。

1.2.3.3 提取温度对总黄酮得率的影响 固定乙醇浓度80%,液料比30∶1,提取时间60 min,考察提取温度50、60、70、80、90 ℃对总黄酮得率的影响。

1.2.3.4 提取时间对总黄酮得率的影响 固定乙醇浓度80%,液料比30∶1,提取温度80 ℃,考察提取时间30、60、90、120、150 min对总黄酮得率的影响。

1.2.4 响应面试验 根据单因素实验结果,以乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)作为影响因素,总黄酮得率为评价指标(Y),应用Box-Behnken中心组合进行4因素3水平的试验设计。因素水平见表1。

表1 响应面实验设计因素与水平

1.2.5 结香花总黄酮抗氧化活性的测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率测定 参考文献[13]并加以修改,将最佳工艺条件下得到结香花总黄酮溶液配制成0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg·mL-1质量浓度的样品溶液。取1 mL样品溶液,加入5 mL 0.06 mmol·L-1DPPH乙醇溶液,充分混匀,在室温下避光反应30 min,于517 nm波长处测定吸光度。并以L-抗坏血酸(VC)作为阳性对照(浓度为0.01、0.02、0.04 mg·mL-1),按以下公式计算清除率。

式中,A0为1 mL蒸馏水+5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;A1为1 mL样品+5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;A2为1 mL样品+5 mL无水乙醇的吸光度。

1.2.5.2 ABTS自由基清除率测定 参考文献方法[14]并改进,将7 mmol·L-1的ABTS溶液与2.45 mmol·L-1的过硫酸钾溶液1∶1混合均匀,在室温避光的条件下静置过夜,制成ABTS贮备液。在12～16 h之内测定,测定时用蒸馏水稀释,使其在734 nm波长下的A值为0.700±0.020。

将最佳工艺条件下得到结香花总黄酮溶液配制成0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mg·mL-1质量浓度的样品溶液。取0.1 mL样品溶液,加入3.9 mL ABTS贮备液,充分混匀,在室温下避光反应10 min,于734 nm波长处测定吸光度。以L-抗坏血酸(VC)作为阳性对照(浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20 mg·mL-1),按以下公式计算清除率。

式中,A0为0.1 mL蒸馏水+3.9 mL ABTS自由基工作液的吸光度;A1为0.1 mL样品+3.9 mL ABTS自由基工作液的吸光度;A2为0.1 mL样品+3.9 mL蒸馏水的吸光度。

1.3 数据处理

所有试验平行测定3次,运用响应面分析软件Design Expert 8.0.6及GraphPad Prism 7.0进行相关图表的绘制以及数据的处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度的影响 由图1可知,总黄酮得率随着乙醇浓度增大先升后降,并在乙醇浓度80%时达到最大值。这与钱慧琴等[15]的研究报道中乙醇浓度对于总黄酮得率影响的变化趋势一致。这可能是因为乙醇浓度为80%时,结香花黄酮类物质的溶出趋于饱和,随着乙醇浓度增加,提取溶剂的极性相对降低,促进结香花中极性小的成分溶出,从而使得总黄酮得率下降。因此选择乙醇浓度70%～90%进行响应面优化试验。

图1 乙醇体积分数对结香花总黄酮得率的影响

2.1.2 液料比的影响 由图2可知,总黄酮得率随着液料比的增大先升后略有下降,并在液料比30∶1时达到最大值。这与王慧芳等[16]研究中的液料比对总黄酮得率影响的研究结果一致。这可能是因为随着液料比的增大,增加了溶质与溶剂的接触面积,有利于黄酮类物质溶出;当液料比为30∶1时,黄酮类化合物的溶出逐渐趋于平稳;继续增加液料比,非黄酮类杂质溶出增多且还会造成资源的浪费。因此,选择液料比20∶1～40∶1进行响应面优化试验。

图2 液料比对结香花总黄酮得率的影响

2.1.3 提取温度的影响 由图3可知,总黄酮得率随着温度的升高先升后下降,并在提取温度80 ℃时达到最大值。这与秦晶晶等[17]的研究报道中提取温度对总黄酮得率的影响的变化趋势一致。当温度升高,分子的热运动加剧,总黄酮的溶出越多,得率越高。当温度升高到一定程度后,黄酮类物质的结构遭到破坏,使得率有所下降。因此选择提取温度70～90 ℃进行响应面优化试验。

图3 提取温度对结香花总黄酮得率的影响

2.1.4 提取时间的影响 由图4可知,总黄酮得率随着时间的增加先升后下降,并在提取时间90 min时达到最大值,这表明在90 min时总黄酮已提取完全,随着提取时间增长,可能会使一些热不稳定成分在长时间提取中遭到破坏,导致总黄酮得率下降。因此选择提取时间60～120 min进行响应面优化试验。

图4 提取时间对结香花总黄酮得率的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 在单因素实验基础上,以乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间为自变量,以总黄酮得率为响应值,采用Design-Expert 8.0.6软件设计4因素3水平,结果见表2,得到总黄酮得率关于乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)和提取时间(D)的二阶多项式方程:

表2 响应面试验设计及结果

Y=22.57-0.10A+1.44B+0.5C-0.23D+0.30AB+1.94AC+0.60AD+0.64BC-0.43BD-0.84CD-1.80A2-1.66B2-1.97C2-2.24D2

表3 方差分析

2.2.3 交互作用分析 为评价两两交互作用对总黄酮得率的影响并确定各因素的最佳水平范围,分别绘制各因素交互作用影响的响应曲面,如图5。响应曲面的形状反映了两因素的交互效应,曲面走势越陡峭,表明两因素交互作用对响应值的影响越显著[18-19]。由图5可知,乙醇浓度和提取温度(图5B),液料比和提取温度(图5D)以及提取温度和提取时间(图5F)两者交互作用显著,表现为响应面曲线走势陡峭。

图5 各因素对总黄酮得率的3D响应面图

2.2.4 最佳条件预测及验证试验 响应面结果分析可知,最佳提取条件为乙醇浓度81.68%,液料比35.29∶1,提取温度83.25 ℃,提取时间85.74 min,预测总黄酮得率为23.04 mg·g-1。考虑到实际操作,最终将其确定为乙醇浓度80%,液料比35∶1,提取温度83 ℃,提取时间85 min。此条件下对建立的数学模型进行验证试验,获得的结香花总黄酮得率的实际测得值为22.76±0.03 mg·g-1,预测值为23.04 mg·g-1,误差为1.23%,小于3%,因此证实了预测值的准确可靠。

2.3 抗氧化活性实验结果

2.3.1 DPPH自由基清除率 由图6可知,当结香花总黄酮质量浓度在0.20～2.00 mg·mL-1范围内,对DPPH自由基的清除率随着质量浓度的增加而增大,且两者存在一定的量效关系。经Graphpad Prism 7计算得结香花总黄酮提取物和VC对DPPH自由基的半数清除率IC50值分别为0.75 mg·mL-1、12.21 μg·mL-1。由此可见,结香花总黄酮对DPPH自由基具有一定的清除能力,但与VC相比能力较弱。

图6 结香花总黄酮和VC的DPPH自由基清除能力

2.3.2 ABTS自由基清除率 由图7可知,当结香花总黄酮质量浓度在0.20～2.00 mg·mL-1范围内,对ABTS自由基的清除率随着质量浓度的增加而增大,且两者存在一定的量效关系。经Graphpad Prism 7计算得结香花总黄酮提取物和VC对ABTS自由基的半数清除率IC50值分别为0.98 mg·mL-1、61.12 μg·mL-1。由此可见,结香花总黄酮对ABTS自由基具有一定的清除能力,但与VC相比能力较弱。

图7 结香花总黄酮和VC的ABTS自由基清除能力

3 结论

通过响应面法建立结香花总黄酮提取工艺的回归方程,得到最佳提取条件为:乙醇浓度80%,液料比35∶1,提取温度83 ℃,提取时间85 min,此条件下,结香花总黄酮得率为22.76±0.03 mg·g-1,相比徐玲[11]在正交工艺优化下的得率7.2 mg·g-1有了明显的提升。体外抗氧化活性研究表明,结香花总黄酮对DPPH和ABTS自由基具有一定清除能力。本研究可为结香花总黄酮的进一步开发利用提供有效支持,为其在食品、药品、保健品等领域开发天然抗氧化剂提供一定的理论依据。韩佳[20]研究也发现,结香花提取物的萃取部位均具有不同的抗氧化活性,其中乙酸乙酯萃取物的铁还原能力最强,氯仿萃取物的清除超氧阴离子自由基能力最强,石油醚萃取物的清除羟基自由基和亚硝酸盐的能力最强。目前遂昌地区的结香以干花作为药用,主要销往安徽亳州等药材市场,加工成品以及深度开发少,其价格波动较大,经济附加值不高。因此加强结香花的基础研究工作,优化其提取的工艺和方法,开发以结香花及其提取物为主的系列产品,可拓宽结香在食品、保健品以及化妆品方面应用,推进结香花产品化,有助于遂昌地区结香资源的可持续发展,打造健康养生农业,建立产业综合体[21]。