正交试验优化香菇粉中麦角甾醇和VD2超声波微波协同提取工艺

胡代花,刘腾美,陈 旺,冯自立

(陕西理工大学生物科学与工程学院,陕西省资源生物重点实验室,维生素D生理与应用研究所,陕西汉中 723000)

维生素D2(VD2)作为维生素D(VD)家族的重要成员,能调节人体钙磷的代谢,促进骨骼的健康。人体VD的缺乏不仅会引起儿童佝偻病、成人的骨质疏松及骨软化症,还与肿瘤、高血压、糖尿病等多发疾病有关[1-2]。由于膳食习惯及生活方式的影响,VD缺乏已成为世界范围内的健康问题并呈现逐年上升的趋势[3]。人体自身不能合成VD2,需要通过食物补充。食用菌具有丰富的营养价值,并能调节人体生理功能而颇受青睐。食用菌中VD2含量较低,但却富含VD2前体-麦角甾醇,通过紫外照射可大幅提高其VD2含量,因此可作为补充VD的重要天然食物来源[4-6]。

目前食用菌中麦角甾醇和(或)VD2提取方法主要有回流提取法[7-9]、超声波辅助提取法[10-13]、闪式提取法[14-15]、超临界CO2萃取法[16-17]和微波辅助提取[18]等方法,但现有方法不同程度具有操作费时、步骤繁琐、生产成本高、安全系数小、不适于批量样品处理和大规模应用等局限性。进一步探索和开发高效、准确、简便的同时测定食用菌中麦角甾醇和VD2含量的方法,具有重要现实意义。超声波-微波协同技术[19-21]一方面利用微波场的热效应及生物效应加速物质的扩散与溶解,同时超声波的空化作用对细胞壁产生机械修剪力,使细胞壁破裂,并促进溶剂和活性成分的双向转移[22],因此具有效率高、能耗低、不破坏有效成分等优点,近几年在天然产物中各类生物活性物质提取方面得到了广泛应用[23-25]。

本文采用超声波-微波协同提取的方法,以紫外照射后的香菇粉为材料,通过单因素和正交试验对香菇中麦角甾醇和VD2的提取工艺进行优化,为其科学研究和产品开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香菇粉 新鲜香菇(购自汉中市过街楼蔬菜批发市场)剪去根部约1 cm,切成约2 mm厚的薄片,置于电热鼓风干燥箱内烘干,粉碎,过40 目筛,装袋密封4度冷藏备用;紫外转化后香菇粉 称取香菇粉200 g于烧杯中,加入无水乙醇1200 mL,所得混悬液在磁力搅拌作用下,采用UV-C紫外照射,照射距离50 cm,照射1 h后,减压蒸除溶剂,置于烘箱中干燥至恒重,装密封袋4 ℃保存备用;麦角甾醇标准品(纯度95.5%)、VD2标准品(纯度99.6%) 西安美仑生物技术有限公司;无水乙醇、正庚烷、石油醚(60～90 ℃)、氢氧化钾 均为分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;乙醇、乙腈、甲酸 均为色谱级,阿拉丁试剂(上海)有限公司;KOH-EtOH溶液 EtOH∶KOH=4∶1 (V/V),其中KOH溶液浓度为4 mol/L。

XO-SM 100超声波微波协同反应工作站 南京先欧生物科技有限公司;1260高效液相色谱仪 Agilent科技(中国)有限公司;快速提高维生素D的紫外光照射装置 实验室研制(专利号ZL2013204910613);KQ-500E超声波清洗仪(功率500 W,频率40 KHz) 昆山舒美超声仪器有限公司;BSA224S-CW电子天平 北京赛多利斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 称取干燥香菇粉200.00 g于烧杯中,加入无水乙醇1200 mL,所得混悬液在磁力搅拌作用下,采用UV-C紫外照射,照射距离50 cm,照射1 h后,减压蒸除溶剂,置于烘箱中干燥至恒重,装密封袋4 ℃保存备用[11]。

1.2.2 麦角甾醇和VD2提取的工艺流程 称取紫外转化后的香菇粉2.00 g,按1∶20 (g/mL)料液比加入40 mL无水乙醇,混悬液置于超声波微波协同反应工作站中,室温条件下,在一定的超声波和微波功率下提取一定时间后,离心10 min(3500 r/min),上清液乙醇定容至40 mL。0.45 μm微孔滤膜过滤提取液,直接进色谱系统分析[11]。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 提取时间 称取紫外转化后的香菇粉2.00 g,按1∶20 (g/mL)料液比加入40 mL无水乙醇,在超声波微波协同反应工作站中,室温条件下,固定超声波功率为400 W,微波功率为400 W,分别提取5、10、20和40 min后,离心10 min(3500 r/min),上清液乙醇定容至40 mL。0.45 μm微孔滤膜过滤提取液,直接进色谱系统分析。考察不同提取时间对麦角甾醇和VD2提取效果的影响。每处理3个重复。

1.2.3.2 超声波功率 固定提取时间为20 min,微波功率为400 W,超声波功率分别为100、200、400和800 W。样品含量测定方法同1.2.3.1。考察不同超声波功率对麦角甾醇和VD2提取效果的影响,每处理3个重复。

1.2.3.3 微波功率 固定提取时间为20 min,超声波功率为200 W,微波功率分别为50、100、200、400和800 W。样品含量测定方法同1.2.3.1。考察不同微波功率对麦角甾醇和VD2提取率的影响,每处理3个重复。

1.2.4 正交试验 根据单因素实验结果,选取提取时间、超声波功率和微波功率作为影响香菇粉麦角甾醇和VD2提取效果的三个因素,分别选取三个水平进行正交试验,实验设计见表1。

表1 正交试验因素与水平表

1.2.5 HPLC含量检测方法

1.2.5.1 标准曲线的绘制 配制系列麦角甾醇和VD2标准溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤后分别进样10 μL,于264 nm处测定吸收峰面积,拟合浓度-峰面积曲线。

1.2.5.2 色谱条件 色谱柱为Agilent RP C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm),柱温为30 ℃,流速1.0 mL/min,进样量10 μL。流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液95∶5 (V/V)混合,检测波长264 nm。

1.2.6 含量测定方法学考察

1.2.6.1 系统适用性实验 麦角甾醇和VD2标准品溶液和样品溶液均进样10 μL,利用液相色谱仪测定,记录色谱图。

1.2.6.2 线性与范围考察 系列麦角甾醇和VD2标准品溶液分别进样10 μL,以264 nm处的吸收峰面积对浓度拟合曲线。

1.2.6.3 重复性实验 称取紫外转化后的香菇粉2.00 g,采用正交试验优化的最佳提取条件制备样品溶液。提取液0.45 μm微孔滤膜滤过,直接进色谱系统分析。每处理3个重复。

1.2.6.4 精密度实验 选取1.2.6.3重复性试验中的所制备样品溶液一个,连续测定5次。

1.2.6.5 稳定性实验 选取1.2.6.3重复性试验中的所制备样品溶液,分别在0、2、4、8、12和24 h进样10 μL测定。

1.2.6.6 加样回收率实验 取已知麦角甾醇和VD2含量的香菇粉3份,按照已知量的80%、100%和120%添加相应的标准品,分别加入5.74、7.18、8.62 mg麦角甾醇标准品,197.63、247.04、296.45 μg VD2标准品,按正交试验优化的最佳提取工艺条件制备样品溶液,依次测定,计算麦角甾醇和VD2回收率。

1.2.7 其他提取方法对比试验

1.2.7.1 皂化回流提取 精确称取1.00 g紫外转化后的香菇粉,混悬于32 mL KOH-EtOH溶液中,磁力搅拌器中85 ℃下回流提取3 h,所得混悬液3500 r/min离心10 min,收集上清液于分液漏斗中,加入10 mL正庚烷进行萃取,静置后收集上层有机相,下层再用等体积萃取剂萃取两次,合并三次萃取液,于旋转蒸发仪蒸干有机溶剂,然后用无水乙醇溶解并定容至10 mL。提取液0.45 μm微孔滤膜滤过,直接进色谱系统分析。每处理3个重复[18]。

1.2.7.2 无水乙醇超声波辅助提取 精确称取1.00 g紫外转化后的香菇粉,加入20 mL无水乙醇制成混悬液,50 ℃超声(500 W)提取20 min,3500 r/min离心10 min,收集上清液,残渣再加20 mL无水乙醇,重复上述操作,合并提取液,无水乙醇定容至40 mL。提取液0.45 μm微孔滤膜滤过,直接进色谱系统分析。每处理3个重复[11]。

1.2.7.3 KOH-EtOH超声波辅助提取 精确称取0.20 g紫外转化后的香菇粉,用10 mL KOH-EtOH溶液进行溶解,60 ℃超声(500 W)提取40 min,3500 r/min离心10 min,收集上清液,残渣再加10 mL KOH-EtOH溶液,60 ℃超声(500 W)提取40 min,重复上述操作,合并2次上清液,置于分液漏斗中,加入10 mL正庚烷进行萃取,静置后收集上层有机相,下层再用等体积萃取剂萃取两次,合并三次萃取液,于旋转蒸发仪蒸干溶剂,然后用无水乙醇进行溶解,并定容至10 mL。提取液0.45 μm微孔滤膜滤过,直接进色谱系统分析。每处理3个重复[10]。

1.2.7.4 微波辅助提取 精确称取0.050 g紫外转化后的香菇粉,溶解于5 mL KOH-EtOH溶液中,520 W微波处理100 s,所得混悬液3500 r/min离心10 min,收集上清液于分液漏斗中,10 mL石油醚(60～90 ℃)萃取三次,合并萃取液,蒸除溶剂,无水乙醇溶解定容至10 mL。提取液0.45 μm微孔滤膜滤过,直接进色谱系统分析。每处理3个重复[18]。

1.3 数据处理

采用SPSS 16.0软件对计算处理后的数据进行统计分析,采用Tukey法进行方差分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取时间对香菇粉中麦角甾醇和VD2提取效率的影响 结果表明(图1)不同提取时间对香菇中麦角甾醇和VD2的提取效率影响较大,其中20 min的麦角甾醇和VD2含量均最高,是5、10、40 min时麦角甾醇提取含量的1.25、1.19和1.01倍,VD2提取含量的1.18、1.12和1.04倍,而20和40 min时麦角甾醇和VD2提取含量间均无显著差异(P>0.05),但两者均与5和10 min的提取含量差异显著(P<0.05)。当以40 min为提取时间对食用菌中麦角甾醇和VD2进行提取时,耗费时间较长,提取效率无显著提高。综合考虑提取效率、节约能源和经济性,确定麦角甾醇和VD2提取时间为5～20 min。

图1 提取时间对麦角甾醇和VD2提取效果的影响

2.1.2 超声波功率对香菇粉中麦角甾醇和VD2提取效果的影响 结果表明(图2)不同超声波功率对香菇中麦角甾醇和VD2的提取效率有一定影响,其中超声波功率为100、200、400 W时麦角甾醇和VD2提取含量间均无显著差异(P>0.05),超声波功率为100、400和800 W时VD2提取率差异也不显著(P>0.05)。当超声波功率为100和400 W时,重复性较200 W差;当超声波功率为800 W时,其VD2和麦角甾醇的提取效果较好,但在实际操作中,液体飞溅现象严重。综合考虑提取效率、节能性和可操作性,确定麦角甾醇和VD2超声波提取功率为100～400 W。

图2 超声波功率对麦角甾醇和VD2提取效果的影响

2.1.3 微波功率对香菇粉中麦角甾醇和VD2提取效果的影响 结果表明(图3)不同微波功率对香菇中麦角甾醇和VD2的提取效率有一定影响,在100、200、400和800 W提取条件下,其VD2和麦角甾醇的提取效果相比均无显著差异(P>0.05)。当微波功率为100 W时,其VD2提取含量是50、200、400 W时的1.07、1.03和1.02倍,其麦角甾醇提取含量是50、200、400 W时的1.10、1.02和1.00倍。综合考虑提取效果和节能两方面因素,确定香菇粉中麦角甾醇和VD2的微波提取功率为100～400 W。

图3 微波功率对麦角甾醇和VD2提取效果的影响

2.2 正交优化实验结果

正交试验结果及分析见表2～表4。结果表明影响香菇粉中麦角甾醇和VD2提取效果的先后顺序为:提取时间(A)>微波功率(C)>超声波功率(B)。方差分析结果表明提取时间对麦角甾醇和VD2提取效果有极显著影响(P<0.001),超声波功率对香菇粉中麦角甾醇和VD2提取效果无显著影响(P>0.05),微波功率对香菇粉中VD2提取效果有显著影响(P<0.05),而对麦角甾醇提取效果无显著影响(P>0.05)。正交试验优化得出的条件为A3B3C2,即室温条件下,超声波功率400 W,微波功率200 W,对料液比为1∶20 (g/mL)的样品溶液提取20 min。此条件下,香菇粉中麦角甾醇含量高达(3.59±0.69) mg/g(n=3),VD2含量高达(123.52±0.69) μg/g(n=3)。

表2 正交试验结果分析(n=3)

表3 麦角甾醇含量方差分析结果

表4 VD2含量方差分析结果

2.3 含量测定方法学考察

由图4可知,所用色谱条件下,单样品总分析时间11 min,麦角甾醇和VD2的保留时间分别为7.6和5.7 min左右,麦角甾醇、VD2与相邻色谱峰均能达到较好的分离,且出峰时间合适,峰形较好,干扰少。麦角甾醇和VD2测定的回归方程、线性范围、回收率、精密度、稳定性和重复性结果见表5。

表5 麦角甾醇和VD2测定的回归方程、线性范围、回收率、精密度、稳定性和重复性

图4 麦角甾醇标准品(A)、VD2标准品(B)溶液及样品溶液(C)HPLC色谱图

2.4 不同提取方法提取效果比较

不同提取方法提取效果比较见表6。结果表明,优化后超声波微波协同提取法在提取温度(室温)、提取时间(20 min)、提取次数(1次)、提取效果(麦角甾醇3.59 mg/g,VD2123.52 μg/g)、重现性(1.11%和0.55%)等方面,与其他四种现有提取方法不同程度具有明显的优势,且该法仅需要提取一次后离心定容,不涉及多次萃取、蒸除溶剂、溶解定容等繁琐步骤,具有良好的操作简便性。

表6 超声波微波协同提取法与其他提取方法比较

3 结论

采用超声波-微波协同提取的方法,通过单因素和正交试验对香菇粉中麦角甾醇和VD2的提取工艺进行优化。结果表明,各因素对麦角甾醇和VD2提取效率的影响程度依次为提取时间>微波功率>超声波功率,最终优化提取条件为:无水乙醇为提取溶剂,提取时间20 min,料液比1∶20 (g/mL),提取温度为室温,超声波功率为400 W,微波功率为200 W。在该提取条件下,麦角甾醇含量高达(3.59±0.69) mg/g,VD2含量高达(123.52±0.69) μg/g。麦角甾醇的平均回收率(n=6)为114.57%,RSD(n=6)为3.83%,VD2平均回收率(n=6)为102.26%,RSD(n=6)为4.95%。该法同比已有方法提取效率高,提取和分析时间短,操作简便,且具有较好的准确性及重现性。