乳酸菌协同小麦胚芽油发酵对黑曲霉生长活性的影响

史梦洁,闫博文,Faizan Ahmed Sadiq,范大明,连惠章,田丰伟,赵建新,*,张 灏,陈 卫

(1.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;2.无锡华顺民生食品有限公司,江苏无锡 214218)

烘焙食品在世界范围内拥有悠久的历史,而我国烘焙产业起步较晚,始于上世纪八十年代,长期以来有着广阔的市场前景。据统计,我国每年因腐败变质而损失的烘焙食品约占总数的20%～30%,给市场和社会带来了极大的经济损失[1]。食品防腐剂能有效防止食物因微生物滋生所引起的腐败变质,延长食品的货架期和食用价值,并具有持续性的效果[2]。根据防腐剂来源主要分为化学防腐剂和天然防腐剂。目前,食品工业中通常以化学防腐剂为主,如山梨酸钾、苯甲酸钠和亚硝酸盐等[3];它具有成本低、效果好等特点。但化学防腐剂的添加可能具有积累性毒性,尤其亚硝酸盐产生致癌性,因此,化学食品防腐剂的添加量被各国严格的控制[4-5]。而天然防腐剂通常是从动植物或微生物代谢产物中分离而来,具有成分天然、无毒的特点,因此,天然防腐剂的开发与使用成为当今市场的研究热点。

乳酸菌可代谢产生多种天然防腐剂,由于其被美国食药管理局认证为GRAS(Generally Regarded As Safe)并通过欧盟的安全资格认定,近年来成为商业开发的理想对象,研究者们针对乳酸菌抑菌活性也开展了系列的研究工作[6]。研究发现乳酸菌在发酵时能够产生具有抗真菌活性的代谢物,如乙酸、丙酸、苯乳酸、小分子肽、羟基脂肪酸等[7]抑菌活性物质。然而,以乙酸和丙酸为例,两种酸对于黑曲霉的最小抑菌浓度分别为1.38～4.32和0.59～1.48 g/L[8],乳酸菌代谢合成该两种物质的生成量却较为有限[9-11],分散在食品体系中导致低于活性物质本身的最小抑菌浓度,从而造成抑菌效果不佳,限制了其在烘焙食品中的应用。

目前,最新研究证实乳酸菌可代谢亚油酸并将其转化为羟基不饱和脂肪酸,由于该物质具有极低的最小抑菌浓度,仅为0.4～0.5 g/L,且乳酸菌可通过自身代谢满足其合成量,因此,在食品中的应用具有极高的潜力[12]。小麦胚芽油(WG)是一种以小麦胚芽为原料的谷物胚芽油,一方面含有高含量(50%～60%)的亚油酸[13],另一方面具有极高的营养价值。因此,本研究拟采用优选乳酸菌与小麦胚芽油协同发酵,观察其对黑曲霉生长抑制活性的影响,进而明确其对面包货架保质期的影响,为烘焙面包的天然生物防腐保鲜提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌菌株 江南大学食品生物技术中心菌库;黑曲霉 中国普通微生物菌种保藏管理中心;MRS固体培养基 蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,牛肉膏 10.0 g,乙酸钠2.0 g,葡萄糖20.0 g,磷酸氢二钾2.6 g,柠檬酸氢二铵10.0 g,硫酸锰0.25 g,硫酸镁0.5 g,吐温-80 1.0 mL,琼脂粉20.0 g,蒸馏水1.0 L,pH6.0～6.4;MRS液体培养基 不添加琼脂粉，其它同MRS固体培养基;马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基 上海博微生物科技有限公司;乳酸、乙酸 分析纯,国药集团化学有限公司;胰蛋白酶、过氧化氢酶 分析纯,美国Sigma公司;小麦粉 五得利面粉集团有限公司;酵母 安琪酵母股份有限公司;小麦胚芽油 中禾健元生物科技有限公司。

SW-CJ-2F型苏州安泰净化工作台 苏州安泰净化公司;GRP-9160型隔水式恒温培养、MJP-150型霉菌培养箱 上海森信实验仪器有限公司;JY20002 型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;Thermo K3酶标仪 赛默飞世尔科技有限公司;SM-302N型切片机 无锡新麦机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗真菌乳酸菌的初筛 初筛采用双层平板法,将MRS培养基倒入培养皿制作下层平板,用乳酸菌在下层平板上划两条2 cm长的平行线,平行线间距1 cm,置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h,将5 mL黑曲霉孢子浓度为106个孢子/mL的PDA半固体培养基倒在下层平板上,轻轻摇晃使上层培养基均匀分布于整个平板,将平板水平放置20 min左右,待其彻底凝固时置于28 ℃恒温培养箱培养20～24 h。检验乳酸菌周围抑菌圈。根据抑菌圈大小为抑菌效果做出评价[14]。

1.2.2 抗真菌乳酸菌的复筛

1.2.2.1 乳酸菌无细胞发酵上清液(CFS)的制备 将菌株从保菌管划线接种于MRS固体培养基中,37 ℃下活化48 h,液体管传代两次。将传代两次后的菌液以1%的接种量接种到mMRS(不含乙酸钠)液体培养基中,置于37 ℃培养箱中培养48 h,将发酵菌液以10000 r/min离心10 min,经0.22 μm滤膜过滤制得无细胞发酵液(cell-free fermentation supernatant,CFS),-20 ℃保存备用[15]。

1.2.2.2 黑曲霉孢子悬液的制备 将黑曲霉从保菌管划线接种于PDA固体培养基上,置于37 ℃培养箱中培养4～7 d后,倒入无菌水,用接种环刮取孢子,将孢子液经已灭菌的纱布过滤,除去菌丝体即为孢子悬液。孢子悬液经充分振荡后,用血球计数板测定孢子浓度,将孢子浓度调整为105个/mL[16]。

1.2.2.3 微孔板法测定乳酸菌无细胞发酵上清液抑菌率 取无菌的96孔微量滴定板,在每个孔中加入10 μL 用mMRS液体培养基稀释到105个孢子/mL的黑曲霉孢子液,加入190 μL各条件下乳酸菌无细胞上清液;同时以190 μL的mMRS培养基,加10 μL 105个孢子/mL的孢子液作为对照。将96孔板置于28 ℃恒温培养箱中培养36 h至对照组生长出霉菌菌丝体,每组测定三个平行。酶标仪检测OD值(580 nm)并计算抑菌率[17]。

抑菌率计算公式为:抑菌率(%)=100-100(ODLAB-ODCFS)/(ODcontrol-ODMRS)

式中:ODLAB表示黑曲霉在乳酸菌CFS中培养36 h的OD值;ODCFS表示乳酸菌CFS的OD值;ODcontrol表示黑曲霉在mMRS培养基中培养36 h后的OD值;ODMRS表示不添加黑曲霉孢子液的mMRS培养基OD值。

1.2.3 抗真菌乳酸菌无细胞上清液pH的测定 将制备的各菌株无细胞上清液装入10 mL离心管中,采用pH计测定上清液pH,平行测定3次。

1.2.4 抗真菌乳酸菌与小麦胚芽油协同发酵上清液抑菌率测定及分析

1.2.4.1 小麦胚芽油抑菌率的测定 将小麦胚芽油进行两倍连续梯度稀释,96孔微量滴定板测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),MIC定义为抑制霉菌生长的最低化合物浓度,每组测定三个平行。在添加黑曲霉孢子悬液之前,层流罩中蒸发去除作为小麦胚芽油溶剂的乙醇[11]。

1.2.4.2 乳酸菌协同发酵上清液的制备及抑菌率测定 将乳酸菌接种到液体培养基中,分别添加入浓度为0、10、20、30 μL/mL的小麦胚芽油,以120 r/min的转速进行摇床培养48 h,将发酵菌液以10000 r/min离心10 min,经过滤制得协同发酵上清液(Synergistic fermentation supernatant,SFS),-20 ℃保存备用。

1.2.4.3 热处理对乳酸菌协同发酵上清液抑菌性能的影响 将乳酸菌SFS分装于15 mL无菌离心管中,橡皮筋捆绑并置于搪瓷杯中,加入一定量去离子水,在电磁炉上进行加热,待水沸腾开始计时,15 min后关掉电磁炉,等待上清液冷却至室温。用微孔板法测试其抑菌效果。

1.2.4.4 中和pH对乳酸菌协同发酵上清液抑菌性能的影响 将乳酸菌SFS用2 mol/L NaOH溶液进行中和[6],调节pH到6.6,经0.22 μm滤膜过滤制得无菌体中和SFS,置于50 mL无菌离心管中保存。微孔板法测试中和处理上清液的抑菌效果。

1.2.4.5 蛋白酶及过氧化氢酶处理对乳酸菌协同发酵上清液抑菌性能的影响 将乳酸菌SFS用1.0 mol/L NaOH调至胰蛋白酶作用的最佳pH7.4,加入胰蛋白酶使其终浓度为1 mg/mL。37 ℃下处理4 h,调pH至代谢产物初始pH。微孔板法检测其抑菌效果。

取2.0 mL的菌株发酵液,将其pH调为7.0,加入20 mg过氧化氢酶,轻轻摇晃至溶解,置于37 ℃保温2 h,再将pH调为排除酸作用时所确定的对照pH,以未经过氧化氢酶处理的发酵液作为对照,测定抑菌活性。

1.2.5 抗真菌乳酸菌与小麦胚芽油协同发酵在吐司面包中的应用研究

1.2.5.1 乳酸菌协同小麦胚芽油发酵组面包 将45 mL发酵乳杆菌菌液、1.5 mL小麦胚芽油和45 g小麦粉,混合均匀,置于恒温培养箱,培养箱温度设置为37 ℃,恒温培养24 h;称取175 g小麦粉、45 g乳酸菌协同小麦胚芽油发酵制得的酸面团、4 g安琪酵母粉、4 g盐和45 mL水置于搅拌缸内混合8 min,搅拌得到用于制作面包的混合面团并置于30 ℃醒发箱醒发25 min;将面团分成小剂,擀制排气,面饼卷起置于烤盒中,再一次醒发成形,设置醒发箱温度37 ℃,相对湿度85%,醒发105 min;然后将醒发的面包面团置于烤箱内,180 ℃烘烤25 min,冷却至室温;面包切片喷洒黑曲霉孢子液进行保质期测定。

1.2.5.2 不同组别的制备 对照组面包的制作:乳酸菌发酵组面包:与1.2.5.1的区别是酸面团发酵时不添加小麦胚芽油,其他制作步骤同上。

化学酸化组面包:制备用乙酸乳酸混合物酸化的酸面团吐司面包作为对照:用0.27%的乙酸(100% w/w)和乳酸(85% w/v)的混合物以1∶4的比例将面团酸化至pH4.1～4.4。

普通对照组面包:面团通过将200 g面粉与120 mL水、4 g盐、4 g糖和4 g酵母混合制备面团,面团和烘烤的方法与酸面团面包的生产相同[18]。

添加小麦胚芽油组面包:将200 g面粉与1.5 mL小麦胚芽油、120 mL水、4 g盐、4 g糖和4 g酵母混合制备面团,面团和烘烤的方法与酸面团面包的生产相同。

丙酸钙(GAP)组面包:将200 g面粉与120 mL水、4 g盐、4 g糖、0.5 g丙酸钙和4 g酵母混合制备面团,面团和烘烤的方法与酸面团面包的生产相同[27]。

1.2.5.3 加速贮藏实验测定面包无霉菌保质期 将各组面包切片,每组切片设置三个平行;在面包切片表面均匀喷洒浓度为8×104个/mL的孢子液,PET包装袋包装,置于28 ℃恒温培养箱观察霉菌生长情况,以出现霉菌斑点作为观察截止点[19]。

1.3 数据处理

所有数据均为三次平行测量的平均值,运用SPSS软件进行方差分析(ANOVA)和最小显著差异分析(LSD),显著差异df水平取P<0.05。研究数据处理均采用Origin 8.0软件分析作图。

2 结果与分析

2.1 抗真菌乳酸菌的初筛

黑曲霉为发酵米面食品中常见腐败真菌,因此,本文以黑曲霉作为指示菌,通过双层平板法从40株乳酸菌中筛选得到12株具有抗真菌活性的乳杆菌,其抗真菌活性的强弱根据抑菌圈的形态及大小进行选择。若抑菌圈边界分明,圈内清晰透明,纵向直径大于1.5 cm为抗真菌活性较强的菌株;若抑菌圈边界模糊,有少量菌丝体生长,纵向直径在1～1.5 cm之间则为抗真菌活性中等的菌株;几乎没有抑菌圈的菌株则认为其不具有抗真菌活性,通过图1可以观察到双层平板法筛选菌株对于黑曲霉菌丝体的生长抑制具有明显差异。本研究筛选得到的12株乳酸菌为双层平板法中具有较强和中等抗真菌活性的菌株,并对其进行后续筛选研究。

图1 抗真菌活性乳酸菌初筛双层平板结果示意图

2.2 抗真菌乳酸菌的复筛及发酵上清液pH测定

基于初筛结果,通过微孔板法进行复筛验证。由于乙酸钠在培养乳酸菌的MRS培养基中具有抑制真菌生长的作用,因此在初筛和复筛实验中对培养基进行了改良,防止黑曲霉受到乙酸钠的干扰而抑制生长[20-21]。通过抑菌率计算公式计算乳酸菌无细胞上清液对黑曲霉的抑制率。此外,为了探究pH是否是影响乳酸菌CFS抑菌率的直接因素,对12株乳杆菌上清液进行pH测定,如表1所示。结果表明,乳酸菌CFS抑菌率并未随着pH的升高而规律下降,即低pH并不是导致其具有较高抑菌活性的直接原因,这与吴燕等[22]的研究结果相似。然而,低pH却是乳酸菌抗真菌活性提高的必要条件,根据经典的“弱酸理论”,低酸环境可使乳酸菌代谢产生的有机酸进入真菌细胞膜释放氢离子酸化细胞质,造成质子梯度的崩溃,从而产生抑菌作用[9,23-24]。

表1 乳酸菌株无细胞上清液pH及微孔板法抑菌率

2.3 抗真菌乳酸菌与小麦胚芽油协同发酵上清液抑菌率测定及分析

2.3.1 小麦胚芽油抑菌率的测定 为了明确小麦胚芽油对黑曲霉生长情况的影响,以乙醇作为溶剂,通过微孔板法测定不同浓度梯度下小麦胚芽油的抑菌活性,结果发现小麦胚芽油对黑曲霉并未表现出抗真菌活性(数据未列出),因此可排除小麦胚芽油对黑曲霉抑菌活性的影响。

2.3.2 乳酸菌协同发酵上清液抑菌率测定 为了验证乳酸菌与小麦培养油协同发酵对黑曲霉生长抑制活性的影响,基于复筛实验结果,分别选取2株抑菌率大于85%的菌株(LP9/LF45)和3株抑菌率小于55%的菌株(LF5/LF27/LP36),将其与不同浓度梯度的小麦胚芽油共同发酵,并对其发酵上清液抑菌率进行测定,结果如图2所示。

图2 复筛菌株与不同浓度小麦胚芽油SFS抑菌率

由图2可知,2株抑菌率大于85%的菌株,在添加不同浓度的小麦胚芽油协同发酵后,其抑菌率未出现显著变化,这可能与这两株菌初始抑菌率较高,加入小麦胚芽油共发酵后效果不明显或未与其产生代谢反应有关;而3株抑菌率小于55%的菌株,在添加不同浓度的小麦胚芽油协同发酵后,发酵乳杆菌LF5的协同发酵上清液随小麦胚芽油添加浓度的增加而抑菌率提高,其他两株菌株协同发酵上清液的抑菌率则并未表现出显著提升。Black等[12]证实Lactobacillushammesii可代谢亚油酸生成羟基脂肪酸,该物质具有较低的MIC值,通过与细胞膜相互作用,提高膜通透性,进而产生抑菌作用[11]。由此推测,发酵乳杆菌LF5可能代谢利用小麦胚芽油生成具有良好抑菌活性成分,使得其共发酵上清液的抑菌率发生明显的提升。

2.3.3 不同处理对乳酸菌协同发酵上清液抑菌性能的影响 为了进一步探究发酵乳杆菌LF5与小麦胚芽油协同发酵上清液中抗真菌活性成分的物质基础,通过对其上清液进行热处理、中和pH、蛋白酶和过氧化氢酶处理,并以具有良好抗真菌活性的植物乳杆菌LP9-小麦胚芽油协同发酵上清液作为对照,初步分析发酵乳杆菌LF5与小麦胚芽油协同发酵上清液中具有抗真菌活性的物质组分,结果如表2所示。

表2 不同处理条件下乳酸菌协同发酵上清液对黑曲霉的抑菌率结果

由表2可知,加热处理和过氧化氢酶处理后LP9-小麦胚芽油组与LF5-小麦胚芽油组抑菌率并未发生显著变化,由此推测其抗真菌活性物质具有良好的热稳定性,且排除了体系中可能含有过氧化氢所产生的抗真菌活性;经蛋白酶处理后,LP9-小麦胚芽油组抑菌活性略有降低,说明其抑菌成分中含有部分蛋白类物质,如抗菌活性肽等。而经pH中和后,两组抑菌率发生显著下降(P<0.05),说明协同发酵上清液中抗真菌活性组分仍主要以有机酸为主,此外还含有部分具有良好热稳定性的抗真菌活性成分有待进一步研究。Liang等[25]通过高速逆流色谱检测发现乳酸菌可代谢植物籽油中亚油酸生成一种单羟基不饱和脂肪酸,并证实了该物质对菌丝体真菌及酵母的抑制效果。而小麦胚芽中亚油酸含量较高,故推测发酵乳杆菌LF5与小麦培养油协同发酵抑菌活性的提升可能与乳酸菌代谢亚油酸产生具有良好抗真菌活性的羟基脂肪酸有关。

2.4 抗真菌乳酸菌与小麦胚芽油协同发酵在吐司面包中的应用研究

为了验证乳酸菌与小麦胚芽油协同发酵对延长面包货架保质期的影响,研究采用优选乳酸菌与小麦培养油共发酵方式制备酸面团,并用于吐司面包的制作。将面包切片表面均匀喷洒一定量的黑曲霉孢子液,观察并记录面包切片表面霉菌生长情况,如图3所示。

图3 不同发酵方式吐司面包的无霉菌保质期贮藏对比

由图3贮藏实验比较可知,小麦胚芽油组和发酵乳杆菌LF5组制得面包,与普通对照组面包的霉菌生长情况相似,均在2～3 d出现肉眼可见霉菌;丙酸钙组和植物乳杆菌LP9组则在第4 d出现肉眼可见霉菌。与其他组别相较,化学酸化组第6 d才观察到霉菌的生长,说明有机酸组分和低pH环境仍是抑制霉菌生长的有效办法[26-27]。此外,植物乳杆菌LP9/发酵乳杆菌LF5协同小麦胚芽油发酵制得面包,两组均在第5 d发现肉眼可见霉菌。Mattia等[27]曾采用哈马斯氏乳杆菌协同蓖麻油酸发酵同样有效抑制了酸面团面包的霉菌生长。由此说明,筛选得到的乳酸菌协同小麦胚芽油发酵可明显提升抗真菌活性,且有助于延长面包的货架保质期。

3 结论

乳酸菌抑制黑曲霉的生长主要与其代谢产生有机酸组分以及创造的低pH环境有关,且其与小麦培养油一同培养可代谢生成具有良好热稳定性的抗真菌活性物质,这可能与乳酸菌代谢小麦胚芽油中的亚油酸生成具有良好抗真菌活性的羟基脂肪酸有关,且该协同作用具有菌株特异性。通过采用优选乳酸菌协同小麦胚芽油发酵制备酸面团面包可知,该方法可有效延缓黑曲霉的生长,延长面包货架保质期,这也为乳酸菌在发酵米面食品中的应用提供新的思路与方向。