基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

胡元庆,林凯玲,周赞虎,李凤霞

(1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州 363000;2.漳州海关综合技术服务中心,福建漳州 363000)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是弧菌科弧菌属的一种革兰氏阴性菌,1950年由Tsunesaburo Fujino[1-2]从一名食物中毒患者体内首次分离。该菌广泛分布于海洋和盐湖中,是海产品中常见的致病菌,食物中毒病例临床上以急性发病、呕吐、腹泻及水样便为主要症状[3-4]。近年来由VP引起的食物中毒已超过沙门菌食物中毒而跃居首位[5]。由于我国是海产品生产和消费大国,VP是食物中毒和沿海地区夏秋季腹泻的主要病因[6],必须建立快速、准确、高效的检测方法来监测海产品中的副溶血弧菌[7]。

检测副溶血弧菌有分子生物学和分析化学法,操作步骤繁琐[8],检测周期较长。目前PCR技术已在VP检测中得到广泛应用,包括常规PCR[9-10]、实时荧光定量PCR[11-13]、EMA-PCR[14]、纳米PCR[15-16]等。双重PCR因其操作简单,所需设备在基层检测机构均有配置,可以同时扩增两条大小不同的片段,能保证较高的特异性[17]。

尽管许多靶向基因(tlh和atpA)被用作VP的种属特异性标记,但其中一些基因在其他弧菌中共享相似的序列,降低了检测方法的准确性和特异性[18]。近年来有研究发现副溶血弧菌中有一种toxR致病基因,参与了某些毒力基因的转运和表达[19],该基因在副溶血弧菌的种内相对保守[20-22],比tlh有更高的特异性[23]。blaCARB-17基因与副溶血弧菌对青霉素的固有抗性有关[18,24]。Li等分析了tlh、atpA和blaCARB-17基因的同源性,基于blaCARB-17基因的PCR特异性为100%,而基于tlh和atpA基因的PCR偶尔会出现假阳性结果[18]。blaCARB-17基因存在于GenBank已经登录的所有293种副溶血弧菌株中,并且所有来源于食品的91株副溶血弧菌携带该基因[18,24],进一步证实了该基因比tlh、atpA基因更为保守。blaCARB-17和toxR基因都具有很高的特异性,普遍存在于各种来源的副溶血弧菌中。国内研究数据显示,覃倚莹等[25]2008年以toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌;白雪松等[26]2012年建立了tlh和toxR基因的双重PCR检测方法;张晓君等[27]2012年建立了基于toxR基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原性副溶血弧菌的方法;黄晨阳等[28]2013年基于toxR基因建立了检测副溶血弧菌的PCR方法;曹冬梅等[29]2013年建立了toxR和tdh基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法;慕艳娟等[9]2015年建立了以toxR-S为靶基因的副溶血弧菌PCR检测方法。国外研究显示,Kim等[30]1999年通过检测toxR基因分析了副溶血弧菌;2008年Rosec等[31]比较了toxR和pR72H为靶基因的PCR;2016年Li[18]等首先建立了针对blaCARB-17的PCR检测技术,目前还没有以此基因建立其他检测方法的相关报道。blaCARB-17作为一种新型的靶基因[21,32]适合设计多重PCR,这为建立双重PCR奠定了良好的分子基础。

在我国检测副溶血弧菌的PCR方法中,大部分以tdh、tlh、trh为靶基因并鉴定菌株的毒性,而以tlh、tdh为靶基因的PCR扩增结果偶尔会产生假阳性的现象[18]。本文针对副溶血弧菌的blaCARB-17和toxR两个基因合成特异性引物,建立了双重PCR的检测方法,以期为基层水产品的大批量安全检测提供可行性方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

对照菌株(包括副溶血弧菌ATCC17802、大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门菌50041) 均由漳州海关综合技术服务中心微生物检测室提供;56个副溶血弧菌分离株 分离于漳州市区的45株(花蛤17株、蛏17株、南美白对虾2株、文蛤9株),龙海的虾2株,东山的虾1株,云霄的南美白对虾7株,厦门的南美白对虾1株;TCBS琼脂和普通肉汤培养基 北京陆桥技术股份有限公司;Tris base 生物纯,Biosharp公司;Regular Agarose G-10琼脂糖 生物纯,西班牙BIOWEST公司;2×Taq Master Mix和Trans 2K DNA Ladder 上海捷瑞生物工程有限公司;Gel Stain(10000×)核酸染料 北京全式金生物技术有限公司。

Tprofessional Thermocycler PCR仪 德国Biometra公司;Red型凝胶成像系统 美国ProteinSimple公司;MIKRO 220R高速冷冻离心机 德国Hettich公司;BSM-30R立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司;SW-CJ-1FD型超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;HSY-B-200恒温振荡摇床 金坛市鸿科仪器厂;DYY-6D电泳仪 北京市六一生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物序列及合成blaCARB-17基因引物参考Li等[18]设计,toxR基因的引物参考Kim等[30]文献设计,引物序列见表1,均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 扩增基因的引物序列

1.2.2 副溶血弧菌的培养 将副溶血弧菌ATCC17802接种于TCBS培养基,37 ℃恒温培养箱培养24 h。挑取TCBS培养基上的单菌落,接种于3% 氯化钠碱性蛋白胨水,37 ℃恒温振荡摇床培养12 h。对照菌接种到普通营养琼脂上,37 ℃培养18～24 h;挑取单菌落接种于LB培养基中,37 ℃,200 r/min振荡培养18～24 h。

1.2.3 副溶血弧菌DNA的提取 移液枪吸取1.2.2中的菌液1 mL于1.5 mL离心管中,高速离心机12000 r/min离心5 min,去上清液,重复1～2次;移液枪吸取1 mL无菌水加入离心管并吹打,高速离心机12000 r/min离心5 min,去上清液;取100 μL无菌水悬浮沉淀;于沸水浴中加热10 min;高速离心机12000 r/min离心5 min,取上清液(即副溶血弧菌DNA模板)到另一洁净的离心管中,-20 ℃保存备用。

1.2.4 单重PCR检测方法建立及反应条件的优化 以副溶血弧菌ATCC17802株的DNA提取物作为模板,分别建立以blaCARB-17和toxR为靶基因的单重PCR。25 μL单重PCR体系为:12.5 μL的2×Taq Master Mix,上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,用ddH2O补足。优化退火温度、退火时间和模板量等反应参数,确定最优的反应条件。

1.2.5 双重PCR检测方法建立及反应条件的优化 以副溶血弧菌ATCC17802株的DNA提取物作为模板,建立以blaCARB-17和toxR为靶基因的双重PCR。25 μL体系中,加12.5 μL的2×Taq Master Mix,两对上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,用ddH2O补足。优化退火温度、退火时间和引物比例等反应参数,确定最优的反应条件。

1.2.6 PCR产物的电泳检测 配制1.5%电泳凝胶,在胶液中加入5 μL Gel Stain(10000×)电泳染料,制成电泳凝胶待用。取5 μL PCR产物上样,98 V电泳35 min。电泳后凝胶于成像系统中成像并拍照。

1.2.7 特异性检测 以大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门菌50041为对照,按照优化后的退火温度、退火时间和引物比例进行PCR扩增,分析其特异性。

1.2.8 灵敏度检测 将副溶血弧菌ATCC17802株用1.2.2的方法培养增菌,并进行10 倍梯度稀释,然后用1.2.3的方法制备不同稀释度菌液的基因组DNA。按上述优化后条件进行双重PCR扩增,电泳确定其灵敏度。

1.2.9 人工污染样品检测 取1.2.8中的菌液1 mL均匀涂在样品虾的表面,放置4 h后,用1 mL无菌去离子水回收菌液,用1.2.3的方法制备基因组DNA。取1 μL DNA模板加入1.2.5已优化的反应体系进行PCR扩增,得出人工污染样品的检测限。

1.2.10 实验室中副溶血弧菌分离株的验证 采用本实验建立的blaCARB-17基因的单重PCR和双重PCR体系分别检验实验室鉴定保存的56个副溶血弧菌分离株,验证双重PCR的稳定性。

2 结果与分析

2.1 单重PCR检测方法建立及反应条件的优化

以副溶血弧菌标准株ATCC17802基因组DNA为模板,分别用特异性引物进行扩增,blaCARB-17和toxR基因均有清晰的条带,大小分别为303、350 bp,见图1。通过梯度PCR对退火温度和时间进行优化,确定blaCARB-17基因最佳扩增条件:95 ℃ 5 min预变性;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环扩增;最后72 ℃延伸5 min。toxR基因最佳扩增条件:95 ℃ 5 min预变性;95 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环扩增;最后72 ℃延伸 5 min。模板最佳用量为3 μL。

图1 单重PCR的扩增结果

2.2 双重PCR检测方法建立及反应条件的优化

首先梯度PCR优化了退火温度和时间,然后对引物比例进行筛选,确定了副溶血弧菌的最佳双重PCR的反应条件。以blaCARB-17和toxR基因建立的双重PCR的最佳扩增条件:95 ℃ 5 min预变性;95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,25个循环;最后72 ℃ 延伸5 min。反应体系(25 μL):12.5 μL的2×Taq Master Mix,blaCARB-17基因上下游引物各1 μL,toxR基因上下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,5.5 μL ddH2O。

图2 双重PCR的扩增结果

2.3 双重PCR特异性检测

应用上述体系对副溶血弧菌ATCC17802和6个对照菌株进行双重PCR扩增,结果显示副溶血弧菌扩增出303和350 bp双条带,其他6株对照菌均未出现任何扩增条带(见图3),表明所建立的副溶血弧菌双重PCR检测方法有很好的特异性。

图3 双重PCR的扩增结果

2.4 灵敏度检测

由图4可知,本实验所建立的双重PCR方法在浓度1×106～1×102CFU/mL均可以扩增出双条带,模板DNA为1×101CFU/mL和1 CFU/mL只有单条带(350 bp),表明本实验双重PCR方法检测模板DNA的检测限为1×102CFU/mL。该双重PCR与很多学者报道的副溶血弧菌多重PCR检测能力基本相当。胡元庆等[33]建立了检测水产品中创伤弧菌和副溶血弧菌的双重PCR方法,检测限为1×102CFU/mL。蒋蔚等[34]建立的水产品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌多重PCR检测方法,检测限为1×102CFU/mL。桑燕娇等[35]建立的副溶血弧菌和溶藻弧菌的双重PCR检测技术,检测限为2×102CFU/mL。与赵现锋等[36]建立的干燥型荧光PCR试剂盒的检测限140 CFU/mL相当。虞艳等[37]建立的水产品中副溶血弧菌交叉引物恒温扩增检测技术的检测限可达14 CFU/mL,与该技术的高灵敏性有关,但其反应所用的Bst DNA聚合酶价格较高。总之,本研究建立的双重PCR不需要昂贵的仪器和试剂,检测限完全满足实际需要。

图4 检测副溶血弧菌纯培养物的双重PCR灵敏度

2.5 人工污染样品双重PCR检测

由图5可知,本实验所建立的双重PCR方法在浓度1×106～1×102CFU/mL均可以扩增出双条带,模板DNA为1×101CFU/mL和1 CFU/mL只有隐约的单条带,表明本实验双重PCR方法检测人工污染样品的检测限为1×102CFU/mL。

图5 双重PCR检测人工污染样品的灵敏度

2.6 副溶血弧菌分离株检测

对56个副溶血弧菌分离株进行blaCARB-17的单重PCR扩增及blaCARB-17和toxR基因的双重PCR扩增,结果表明56个菌株可扩增出大小约为303 bp单条带(结果见图6)和350、303 bp的双条带(结果见图7)。参考Li等[18]建立的blaCARB-17单重PCR,本研究成功对56株副溶血弧菌扩增到预期条带,在此基础上建立的双重PCR也成功扩增到2条目的条带,符合率100%,表明本实验建立的双重PCR方法准确可靠,无假阳性和漏检情况。

图6 blaCARB-17单重PCR的扩增结果

图7 双重PCR的扩增结果

3 结论

本实验建立了以blaCARB-17和toxR为靶基因的双重PCR方法,主要用于检测水产食品中的副溶血弧菌，优化了双重PCR的退火温度、退火时间和引物比例等反应参数,检测了双重PCR的特异性和灵敏性,通过检测人工污染样品和副溶血弧菌分离株验证了其稳定性。该双重PCR最低检测限为1×102CFU/mL,可特异地检测食品中的副溶血弧菌污染。