两种皮氏蛾螺ACE抑制肽的稳定性和抑制活性

刘鑫烔,宋铖铖,乔变文,付颖寰

(1.大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034;2.国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034;3.大连工业大学轻工与化学工程学院,辽宁大连 116034)

高血压(hypertension)是一种以体外循环动脉压升高为特征的临床综合征[1-2],是人类最常见的心血管疾病之一。血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)属二肽羧肽酶,在调节血压、维持电解质平衡、保护肾脏和血管心肌重塑过程中起着重要作用[3-5]。在肾素-血管紧张素系统(Renin Angiotensin System,RAS)中,ACE可使血管紧张素I(Ang I)转化为具有收缩血管作用的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ),后者使血管进一步收缩、血压升高[6]。近年来,对于治疗高血压疾病已经取得显著效果,其中化学合成的ACE抑制剂如Lisinopril,Captopril等,在治疗高血压方面已取得较好的效果。但也带来了一定的副反应,如,头晕恶心、干咳、肾毒性水肿、皮疹等,甚至会造成胎儿先天畸形[7-8]。近年研究发现,多种天然食物源的活性多肽也具有较好的ACE抑制活性[9],且对人体不产生副作用,已成为研究的热点。

皮氏蛾螺(Volutharpaampullacealperryi)ACE抑制肽是一种食源性活性多肽,由于其价格便宜易获得、生理活性强,毒副作用小,是近几年研究的热点[10-12]。但是,食源性活性多肽的结构不稳定,易被外界环境干扰,造成口服利用率较低,影响其生理活性[13]。一些食源性活性多肽在体外实验中具有较好的ACE抑制活性,在体内却无明显抑制作用[14]。产生这种现象可能由于多肽经过体内多种酶的消化作用,使其氨基酸序列肽链断开,结构改变,生物活性丧失[15]。近年来研究显示,高温、金属离子、食盐浓度都会影响ACE抑制肽活性[16-17]。雄蚕蛾酶解肽(MSH)在盐度小于4%,温度低于60 ℃,酸碱度在4～8之间时,MSH表现出良好的稳定性[18]。因此,食源性ACE抑制肽在不同温度、金属离子、盐、糖和人体的消化吸收对ACE抑制肽稳定性和抑制率的影响需进一步验证。He等[19]研究皮氏蛾螺在煮沸过程中品质和感官品质的变化,长时间加热煮沸会使肉质变老,口感差。Sun等[20]以Zn-SBA-15固定化ACE作为亲和载体,根据载体与肽亲和力的不同分离出两种ACE抑制肽:Ile-Val-Thr-Asn-Trp-Asp-Asp-Met-Glu-Lys(IVTNWDDMEK)和Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly(VGPAGPRG)。这两种多肽的降压机理、生理活性还需要进一步研究。

本文采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测IVTNWDDMEK和VGPAGPRG两种皮氏蛾螺ACE抑制肽在不同处理条件下的保留率和抑制率,研究其稳定性及抗消化性,为探究ACE抑制肽的加工方式和在体内的消化过程提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皮氏蛾螺抑制肽Ile-Val-Thr-Asn-Trp-Asp-Asp-Met-Glu-Lys(IVTNWDDMEK)、Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly(VGPAGPRG) 纯度均大于98%,委托南京莱昂生物科技有限公司合成;磷酸二氢钾 分析纯,天津市科密欧化学试剂厂;葡萄糖 分析纯,天津市科密欧化学试剂厂;乙腈 色谱级,Specturm chemical MFG. CORP.。

Waters e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司;荧光酶标仪F200 德国Tecan公司;SunFire C18(5 μm,4.6 mm×150 mm) 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 RP-HPLC定量检测多肽含量 采用Waters e2695高效液相色谱仪,色谱柱为SunFire C18(5 μm,4.6 mm×150 mm);流动相为含0.05%三氟乙酸水溶液(A)和乙腈(B);检测波长:220 nm;流速1 mL/min;进样量10 μL。IVTNWDDMEK的检测条件:流动相A:B为90∶10 (v/v);VGPAGPRG的检测条件:流动相A∶B为95∶5 (v/v)。

1.2.2 ACE抑制活性的测定 采用Sun等[20]的方法检测ACE抑制活性,稍作修改。取50 μL马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate,HHL)(5 mmol/L)于1.5 mL离心管中,加入20 μL多肽样品溶液,充分混匀,37 ℃下恒温水浴预热5 min,预热后加入20 μL 0.01 U/mL纯ACE酶。37 ℃恒温水浴保温60 min后,加入10 μL 0.2 mol/L HCl终止反应,通过RP-HPLC(水)用Gall 12S05-2546 C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)测定混合物的马尿酸含量。等度流动相水(0.05%三氟乙酸)∶乙腈在75∶25 (v/v)处的流速为0.5 mL/min,并使用DAD检测器在228 nm处监测流出液。用纯净水做空白对照,根据公式(1)计算各反应液ACE抑制率。

式(1)

式中:A样品-样品组马尿酸的峰面积;A对照-纯净水中马尿酸的峰面积。

1.2.3 各因素对皮氏蛾螺ACE抑制肽稳定性和抑制活性的影响

1.2.3.1 温度对皮氏蛾螺ACE抑制肽稳定性和抑制活性的影响 分别取2.00 mg/mL的多肽溶液于1.5 mL离心管中。分别置于37、60、80、100 ℃下恒温水浴,分别于0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取100 μL,过0.45 μm水系滤膜后,按照1.2.1的检测方法对两种多肽含量进行测定。根据公式(2)计算ACE抑制肽保留率。再分别于37、60、80、100 ℃处理6 h后取20 μL多肽样品溶液按照1.2.2的检测方法公式(1)测定并计算各反应液的ACE抑制率。

式(2)

其中:Ab为反应后抑制肽峰面积;A0为反应前抑制肽的峰面积。

1.2.3.2 金属离子对皮氏蛾螺ACE抑制肽稳定性和抑制活性的影响 取ACE 抑制肽溶液(2 mg/mL,100 μL)分别加入100 μL的5 mmol/L KCl、CaCl2、CuSO4、MgSO4、ZnSO4和FeCl3,在37 ℃下恒温水浴2 h。过0.45 μm水系滤膜后,按照1.2.1的检测方法对两种多肽含量进行测定。根据公式(2)计算ACE抑制肽保留率。再取100 μL 2.00 mg/mL多肽溶液分别加入100 μL的5 mmol/L KCl、CaCl2、CuSO4、MgSO4、ZnSO4和FeCl3,在37 ℃下恒温水浴2 h,按照1.2.2的检测方法和公式(1)测定并计算各反应液的ACE抑制率。

1.2.3.3 葡萄糖和NaCl对皮氏蛾螺ACE抑制肽稳定性和抑制活性的影响 取ACE抑制肽溶液(2 mg/mL,100 μL)分别加入100 μL的3%、6%、9%、12%的葡萄糖;3%、6%、9%、12%的NaCl,在100 ℃下恒温水浴振荡20 min。过0.45 μm水系滤膜后。按照1.2.1的检测方法对两种多肽含量进行测定。根据公式(2)计算ACE抑制肽保留率。再取100 μL 2.00 mg/mL多肽溶液分别加入100 μL的3%、6%、9%、12%的葡萄糖;3%、6%、9%、12%的NaCl,在100 ℃下恒温水浴振荡20 min,按照1.2.2的检测方法和公式(1)测定并计算各反应液的ACE抑制率。

1.2.3.4 胃蛋白酶消化实验 胃蛋白酶消化实验参照Tavares等[21]的方法,稍作修改进行测定。分别取2 00 μL 2.00 mg/L ACE抑制肽溶液,1800 μL人工胃液(取稀盐酸16.4 mL,胃蛋白酶10 g,用蒸馏水定容至1 L。稀盐酸溶液中含9.5%～10.5%的HCl)于2 mL离心管中,37 ℃下恒温水浴,分别于0、30、60、90、120 min取200 μL,向其中加入37 μL 0.5 mol/L NaOH中和至pH=7.0,100 ℃恒温水浴10 min灭酶,过0.45 μm水系滤膜后,按照1.2.1的检测方法对两种多肽含量进行测定。根据公式(2)计算ACE抑制肽保留率。再分别取2.00 mg/mL多肽溶液及在胃液处理0、30、60、90、120 min时的反应液,按照1.2.2的检测方法和公式(1)测定并计算各反应液的ACE抑制率。

1.2.3.5 胰蛋白酶消化试验 胰蛋白酶消化实验参考《中国药典》2015版[22]的方法测定,稍作改动。分别取200 μL 2.00 mg/L ACE抑制肽溶液,1800 μL人工肠液(称取磷酸二氢钾3.4 g,用250 mL蒸馏水溶解,用NaOH(0.1 mol/L)调节pH为6.8;称取2.5 g胰蛋白酶,用100 mL蒸馏水溶解,混合两种溶液并定容至500 mL)于2 mL离心管中,37 ℃下恒温水浴,分别于0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取200 μL,100 ℃恒温水浴10 min灭酶,过0.45 μm水系滤膜后,按照1.2.1的检测方法对两种多肽含量进行测定。根据公式(2)计算ACE抑制肽保留率。再分别取2.00 mg/mL多肽溶液及在肠液中处理0、0.5、1、2、3、4、5、6 h时的反应液,按照1.2.2的检测方法和公式(1)测定并计算各反应液的ACE抑制率。

1.3 数据处理

数据结果以三个平行样本的平均值±标准差(M±SD)表示,并使用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析,P<0.05表示数据存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 两种皮氏蛾螺ACE抑制肽热稳定性和抑制活性

ACE抑制肽热稳定性的影响如图1所示。十肽IVTNWDDMEK稳定性最佳温度是37和60 ℃,在80 ℃时,随着处理时间的延长,6 h后多肽保留率下跌了20%,在100 ℃时,随着处理时间的延长,6 h后多肽保留率下跌75%,八肽VGPAGPRG稳定性较好,能够长时间抵抗高温加热。十肽IVTNWDDMEK的热失活分为两步,首先是二聚体分解成单个亚基,然后亚基发生不可逆变性[23-24]。然而,不同的肽链长度或氨基酸组成与连接蛋白的引入可能会改变蛋白质的拓扑结构和性质。因此,在多肽的加工过程中应控制好温度,尽量避免高温环境。

图1 温度对IVTNWDDMEK(A)和VGPAGPRG(B)的热稳定性影响

经过不同温度条件处理后的两种皮氏蛾螺ACE抑制肽的抑制活性结果如图2所示,尽管IVTNWDDMEK多肽在80 ℃和100 ℃高温下的稳定性差,但是ACE抑制活性不仅没有降低,反而增加了,这可能是因为肽链在高温下分解,分解成小肽产生协同效应,从而提高ACE抑制活性。多肽VGPAGPRG在不同的温度下均有良好的稳定性,但在80 ℃和100 ℃处理时ACE抑制活性略有下降,在100 ℃加热6 h之后,活性保留率为94%左右,这可能是由于在高温使肽链被破坏从而抑制其活性。Escudero等[25]从香肠中分离出的17种ACE抑制肽,经过117 ℃加热6 min,仅有三种能够保持原来的抑制活性。醋蛋多肽ACE抑制活性的保持率随着温度的升高而降低,当温度达到100 ℃时,活性保留率为60%左右。因此,本实验研究的皮氏蛾螺酶解肽在高温下有较好的稳定性。

图2 温度对IVTNWDDMEK(a) 和VGPAGPRG(b)抑制率的影响

2.2 金属离子对皮氏蛾螺ACE抑制肽稳定性和抑制活性的影响

食品在加工、储存和运输过程中,难免会接触到各种金属离子,不仅会影响食品的色泽,还会影响食品的风味品质。本实验采用不同金属离子处理多肽,结果如图3所示。在相同浓度K+、Mg2+、Cu2+、Ca2+对IVTNWDDMEK稳定性无显著影响(P<0.05),Zn2+、Fe3+可影响多肽的稳定性。在Fe3+存在时,IVTNWDDMEK保留率为93.83%;钾离子是维持体液渗透压和心脏功能的重要离子。K+、Mg2+不影响ACE抑制活性,而Cu2+、Ca2+可显著增强ACE抑制活性。在Ca2+存在时,IVTNWDDMEK抑制率为85.53%。Fe3+可使IVTNWDDMEK对ACE抑制活性大大降低,抑制率仅为11.15%。Zn2+的添加增强了IVTNWDDMEK对ACE的抑制活性,添加了Zn2+的IVTNWDDMEK对ACE抑制活性为97.65%,VTNWDDMEK可以通过抑制锌离子与ACE结合,从而显著抑制ACE活性。

图3 金属离子对IVTNWDDMEK和VGPAGPRG稳定性(A)和ACE抑制活性(B)的影响

Zn2+和Fe3+存在时会使VGPAGPRG对ACE抑制活性大大降低,VGPAGPRG的抑制率分别为11.16%、17.19%。其原因可能是锌离子是ACE酶的辅酶,添加Zn2+可以提高ACE的活性,从而降低多肽的抑制活性,在Fe3+存在时,VGPAGPRG的保留率为97.04%,在Ca2+存在时,VGPAGPRG的抑制率为81.24%;在Cu2+存在时,IVTNWDDMEK抑制率为92.63%,VGPAGPRG的抑制率为84.66%;Cu2+、Ca2+可与多肽结合产生协同作用,从而增强抑制活性。而Fe3+可以与多肽侧链基团相结合,改变肽的化学结构,从而使多肽的抑制活性降低。杨峰等[26]研究表明K+、Zn2+对醋蛋多肽ACE抑制活性影响较大,分别为65%、70%。因此,在制备多肽时,可以加入适当的Cu2+、Ca2+的同时避免与Fe3+接触。

2.3 高浓度的葡萄糖和NaCl对皮氏蛾螺ACE抑制肽稳定性的影响

糖和盐是最常见的食物成分。糖主要影响食物的风味、味道、颜色等感官品质。高浓度的糖也是一种食品防腐剂。还原糖和氨基酸在加热条件下发生美拉德反应,赋予食物独特的风味。医学研究证明高血压的发生与长期摄入高浓度盐有关[27]。本实验采用葡萄糖和氯化钠对多肽的稳定性和ACE的抑制活性进行了研究,结果如图4所示。总体上来看IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的稳定性和抑制率会随着葡萄糖浓度和氯化钠浓度的升高而有所降低,当葡萄糖浓度为3%时IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的保留率和抑制率分别为96%、94.9%、83.2%、76.8%。但当葡萄糖浓度达12%时,IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的保留率分别为94.2%,90.7%,ACE抑制率降低为68.9%和54.5%,可见糖浓度的增加对ACE抑制肽的抑制率影响较大。

图4 葡萄糖对IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的稳定性(A)和ACE抑制活性(B)的影响

如图5所示,当盐浓度为3%时,IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的保留率和抑制率分别为98.48%、98.13%、77.6%和73.2%,但当食盐浓度为12%时,IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的稳定性分别为92.5%,67.9%。抑制率降为55.9%和59.4%,对ACE抑制率影响较大。陈季旺等[28]研究发现一定量的NaCl对鱼降压肽ACE抑制活性影响不大,当NaCl浓度较高时,明显影响鱼降压肽ACE抑制活性。因此食盐对两种ACE抑制肽的抑制活性有影响,特别是较高浓度的食盐。所以在加工过程中应避免与较高浓度的食盐和较高浓度的糖接触。

图5 NaCl对IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的稳定性(A)和ACE抑制活性(B)的影响

2.4 皮氏蛾螺ACE抑制肽在人工胃液和模拟肠液中的稳定性和抑制活性

ACE抑制肽在消化系统中的稳定性如图6所示。八肽VGPAGPRG具有较高的抗消化能力,在胃液环境中稳定性好,120 min后多肽保留率达95%,然而,VGPAGPRG在肠道液体环境中稳定性较差,6 h后多肽保留率仅为65%。IVTNWDDMEK在胃肠环境中稳定性差,在胃液中消化迅速,120 min后多肽损失75%～85%,多肽保留率仅为33%。VGPAGPRG在胃液环境中不被消化,在肠液环境中缓慢降解,这通常是最理想的膳食形式,多肽的消化吸收与多种功能和健康益处相关,包括抑制血压、抗癌、降血糖、抑制脂肪堆积、增强维生素和矿物质吸收[29-30]。肽的消化率受氨基酸类型的影响很大,这取决于肽的理化特性以及氨基酸的序列和组成。十肽中所含的芳香族氨基酸Tyr(酪氨酸)残基可能是其在胃液中不稳定的主要原因,八肽在肠液中易被降解可能是由于含有Arg(精氨酸)残基,具体消化结果仍需进一步实验验证。

图6 IVTNWDDMEK和VGPAGPRG在人工胃液(A)和模拟肠液(B)中的稳定性

胃液中VGPAGPRG相对稳定,ACE抑制活性略有降低。IVTNWDDMEK和VGPAGPRG在胃液2 h和肠液6 h的抑制率分别为30.47%、15.74%、28.01%、12.33%。可能是肽酶水解的肽链破坏了肽链,抑制了肽链的活性。IVTNWDDMEK多肽在胃液中的稳定性较差,但仍能保持良好的ACE抑制活性。这两种多肽在胃肠液中相对较弱,其ACE抑制活性有所降低,这可能是由于蛋白水解多肽、肽链断裂、活性受到抑制所致。

图7 胃液和肠液反应6 h后IVTNWDDMEK和VGPAGPRG的ACE抑制活性

3 结论

本文以两种皮氏蛾螺ACE抑制肽为研究对象,通过反相高效液相色谱技术测定两种皮氏蛾螺酶解肽的热稳定、抗胃肠道消化吸收能力、金属离子稳定性和高盐、高糖的稳定性和抑制活性。实验结果表明,长时间高温100 ℃加热,会改变多肽的稳定性,使肽键断裂,降低生理活性。通过模拟体外胃肠消化,两种多肽在体内的经过2 h胃液和6 h肠液的消化吸收,酶解肽一定程度被分解成小分子多肽,但分解后仍具有ACE抑制活性。金属离子和Fe3+的添加会降低ACE抑制活性,锌离子是ACE酶的辅酶,Zn2+可能与多肽的侧链基团结合,影响其抑制活性。在37、60、80 ℃温度下6 h内两种ACE抑制肽均有较好的热稳定性,其中VGPAGPRG表现最优的稳定性。经人工胃液反应2 h后和人工肠液反应6 h后,八肽VGPAGPRG稳定性要好于十肽IVTNWDDMEK。虽然这两种肽经过胃肠液的消化,稳定性降低,多肽分解成小分子物质,但仍然具有ACE抑制活性,说明进入体内可以被良好的消化吸收,并且还具有ACE抑制活性。在金属离子中的稳定性较好,但是铁离子会抑制ACE抑制活性,在添加时要注意避免添加包含Fe3+离子的物质,高盐和高糖也会影响ACE抑制效果。IVTNWDDMEK和VGPAGPRG具有较好的热、离子、高盐、高糖稳定性和良好的抗胃肠道消化吸收能力。为研究ACE抑制肽的生物口服利用度提供了理论基础。