汽爆处理对油茶籽饼粕中茶皂素理化性质的影响

李 恒,郑晓燕,郑丽丽,杨 旸,校 导,艾斌凌,潘永贵,盛占武,*

(1.海南大学食品科学与工程学院,海南海口 570228;2.中国热带农业科学院海口实验站,海南海口 570102;3.海口市香蕉生物学重点实验室,海南海口 570102)

油茶(Camelliaoleifera Abel)又名茶子树,属于山茶(Camellia)科山茶属山茶亚属油茶组,是世界四大木本油料植物之一,主要分布于我国长江流域及以南地区,是我国特有的食用油料树种[1]。油茶籽饼粕作为油茶榨完油后的副产物,含有茶皂素、多糖、蛋白质等多种功能成分,具有较高的利用价值[2]。茶皂素(Tea Saponin)又名茶皂甙,是存在于山茶科植物中的一类齐墩果烷型三萜类皂苷混合物[3],不仅具有天然的表面活性作用,还有抑菌、杀虫、抗癌等功效[4-7],可应用于饲料、医药和日化等方面[8-10]。

蒸汽爆炸(SE)是目前公认的处理农业副产物高效、清洁的技术之一,近年来在活性化合物提取中不断创新[11]。蒸汽爆破技术的原理是将原料置于高温高压环境中,利用过热饱和蒸汽对物料进行处理,使原料孔隙中充满蒸汽,然后瞬间释放高压,使原料孔隙中的饱和蒸汽急剧膨胀而发生爆破,原料细胞壁结构被破坏而形成微孔,从而使小分子物质从细胞中释放出来[12]。魏锦锦等[13]运用汽爆技术使得黄酮和绿原酸的得率从7.63和0.25 mg/g 显著提高到了26.83 和1.22 mg/g;张棋等[14]运用汽爆技术处理后总黄酮提取量是未经预处理粉葛提取量的2.32倍;靳羽慧等[15]运用汽爆技术预处理后豆渣中黄豆黄苷较汽爆前增高了17.75倍。基于汽爆的原理:采用汽爆预处理结合传统提取方法势必可以有效提高茶皂素的提取率,同时改变其理化性质。然而,目前利用汽爆预处理提取皂苷的研究在国内外还鲜有报道。

因此,本研究根据上述文献报道和前期预实验结果,选择汽爆压力0.9～2.1 MPa和时间30～150 s处理油茶籽饼粕,探明不同预处理条件对茶皂素提取率的影响,并分析汽爆前后对茶皂素理化性质的影响,以期为汽爆技术在茶皂素提取方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶籽饼粕 海南新美特科技有限公司;65%茶皂素 上海绿叶生物科技有限公司;浓硫酸 广州化学试剂厂;香草醛 国药集团化学试剂有限公司;乙腈(色谱纯) 美国天地公司;所有分离用有机溶剂 均为国产分析纯。

QBS-80汽爆试验台 河南省鹤壁正道生物能源有限公司;Agilent 1100 & Esquire HCT液相色谱-质谱联用仪,配有电喷雾离子源(ESI) 美国安捷伦公司 德国Bruker公司;JSM-7500F扫描电子显微镜 日本电子株式会社;UV-1800紫外-可见分光光度计 岛津仪器有限公司;BZY-1自动表面张力仪 上海衡平仪器仪表厂。

1.2 实验方法

1.2.1 汽爆预处理 将干燥的油茶籽饼粕放入蒸汽爆破物料腔内,分别于0、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 MPa条件下处理60 s,选出最适压力并相应处理0、30、60、90、120、150 s,汽爆后收集物料,50 ℃烘干10 h后粉碎,过40目筛备用。

1.2.2 油茶籽饼粕的微观结构 取干燥样品1 g粘在带有导电胶带的样品台上,用离子溅射方法喷金后,用扫描电镜进行观测。

1.2.3 茶皂素的提取及纯化

1.2.3.1 茶皂素的提取 提取方法参考文献[17],称取10 g脱脂茶籽粕置于500 mL锥形瓶中,按料液比为1∶20加入70%乙醇溶液,60 ℃水浴浸提2 h,提取两次,将得到的两次提取液合并备用。

1.2.3.2 茶皂素的纯化 纯化方法参考文献[18],将上面提取的茶皂素溶液倒入分液漏斗,用正丁醇萃取3次。合并正丁醇层并用旋转蒸发仪在温度35 ℃,转速70 r/min进行浓缩,将浓缩液按照1∶5的比例倒入丙酮中,得到茶皂素沉淀置于50 ℃真空干燥箱内烘10 h,称重后装袋。所有处理3次重复。

1.2.4 茶皂素提取率的计算

1.2.4.1 标准曲线的制作 取65%茶皂素0.1 g,用80%乙醇溶解,定容至50 mL,配成1.3 mg/mL茶皂素标准溶液,充分摇匀后备用。方法参考傅春玲等[16]方法。

取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL标准溶液定容至7.0 mL,分别配成0.0929、0.1857、0.2786、0.3714、0.4643 mg/mL茶皂素标准溶液。分别取0.5 mL稀释后的标准溶液于10 mL具塞试管中,加入0.5 mL 8%的香草醛溶液后,放置于冰水浴中,加入4 mL 77%的硫酸溶液,充分摇匀,60 ℃加热15 min后冰水浴10 min,取出至室温,以试剂空白为对照,在UV-1800紫外-可见分光光度计上550 nm波长处测吸光度(A)。以A为纵坐标,茶皂素质量浓度(mg/mL)为横坐标,得标准曲线方程:y=0.9053x-0.0387,R2=0.99931。

1.2.4.2 茶皂素的测定及提取率的计算

式中:Y表示茶皂素的提取率,%;C表示样品溶液的浓度,mg/mL;V表示样品溶液的体积,mL;n表示样品溶液稀释倍数;m表示茶籽粕的质量,mg。

1.2.5 茶皂素表面活性测定 表面张力、起泡性、乳化性的测定均参考李迅[19]的方法。

1.2.5.1 表面张力测定 将1.2 MPa、60 s汽爆条件下提取的茶皂素和对照处理提取的茶皂素分别配制成浓度为0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.5%、1%的梯度溶液,用表面张力仪分别测定各个样品梯度溶液的表面张力值。

1.2.5.2 起泡性的测定 将1.2 MPa、60 s汽爆条件下提取的茶皂素和未汽爆提取的茶皂素分别配制成浓度为0.01%、0.05%、0.1%、0.5%(W/V)的梯度溶液,从中吸取2 mL置于25 mL具塞试管中,上下振荡30次,测量30 s和5 min时的起泡高度,分别记为A和B。A为起泡能力;B/A为泡沫稳定性。

1.2.5.3 乳化性的测定 将1.2 MPa、60 s汽爆条件下提取的茶皂素和未汽爆提取的茶皂素分别配制成1%水溶液作为水相,正己烷作为脂相,分别吸取6 mL水相与脂相于20 mL玻璃瓶中,超声混合2 min后,分别记录0、30 min和24 h时乳化层厚度。

1.2.6 红外光谱分析 茶皂素与溴化钾1∶100混匀,研钵中研磨10 min,压制成片,用傅叶变换红外光谱仪,在500～4000 cm-1区间进行扫描。

1.2.7 茶皂素单体定性分析鉴定 将汽爆处理提取纯化得到的茶皂素用无水甲醇配成浓度1 mg/mL的溶液。使用液相色谱-质谱联用技术进行定性分析。

色谱条件为:进样量1 L,流动相A相:99.9%水+0.01%甲酸,B相:甲醇,洗脱条件为:0～3 min,10% B～35% B,3～12 min,35% B～95% B,12～18 min,95% B。流速0.2 mL/min,柱温30 ℃,检测波长200～300 nm。

质谱条件为:离子源:ESI,正负离子同时扫描,质量扫描范围m/z 1000～1300,加热模块温度250 ℃,CDL温度200 ℃;雾化气流速1.5 L/min,干燥气流速10 L/min,检测器电压1.7 kV。

1.3 数据分析

所有实验重复三次,用Origin 8.5软件作图,采用DPS的单因素方差分析对实验结果进行差异性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 汽爆压力对茶皂素提取率的影响

维持压力时间为60 s,不同汽爆压力下处理对茶皂素的提取率如图1所示。在0～1.2 MPa压力范围内,随着汽爆压力升高,茶皂素的提取率由0 MPa的21.8%增加到1.2 MPa时的30.4%,之后降低到2.1 MPa的23.1%,汽爆压力为1.2 MPa时茶皂素提取率与其它处理组相比差异显著(P<0.05)。这可能是由于茶皂素主要分布在饼粕细胞内,汽爆处理过程中介质和内部的蒸汽释放出强大的冲击波,破坏了植物多孔介质的基质结构,致使茶皂素等成分溶解和扩散[20]。当蒸汽爆破压强过高时,茶皂素得率反而会下降,这可能与过高的温度和压强使得蛋白质与羰基化合物发生了美拉德反应,最终生成棕色甚至是棕黑色的大分子物质[21]。从茶皂素提取率和节能方面考虑,汽爆压力选择1.2 MPa较为合理。

图1 汽爆压力对茶皂素提取率的影响

2.2 汽爆时间对茶皂素提取率的影响

汽爆处理时间是影响茶皂素提取率的另一个重要因素,图2表明随着汽爆时间的延长,茶皂素提取率由0 s时的21.7%增加到60 s时的31.2%,在汽爆时间为60 s时达到最高,随着汽爆时间的延长,提取率降低到150 s时的26.7%,60 s时的提取率与其它处理组(除30、90 s外)相比差异显著(P<0.05)。汽爆过程是先加压使蒸汽进入生物质的纤维组织和细胞内,然后在短时内(0.00875 s)迅速释放压力[22]。因此,汽爆处理的时间太短,物料在高温高压的环境下反应不够充分,饼粕的细胞结构没有被完全破坏,茶皂素无法有效地释放出来;作用时间过长则茶皂素可能发生水解反应而降解[23]。从节能的角度看汽爆时间选择60 s更合适,在此条件下茶皂素的提取率为31.2%,汽爆法可以提高茶皂素的提取率,与Sui等[24]研究结果一致。汽爆法提取的茶皂素得率高于微波辅助提取法的12.38%[25],乙醇-超声波结合法的18.54%[26],可广泛用于茶皂素的提取。可见,汽爆预处理提高了茶皂素的提取率。

图2 汽爆时间对茶皂素提取率的影响

2.3 汽爆处理对茶皂素表面张力的影响

茶皂素的渗透、润湿、乳化、去污、分散和增溶等作用都是基于其表面活性[27]。表面张力和临界胶束浓度通常被用来评价表面活性剂的表面活性,表面活性能力与活性剂的使用浓度有关[19]。由图3可知,汽爆和对照提取的茶皂素水溶液的表面张力值随着浓度的增加有一个明显的下降过程,并且最终趋于稳定,汽爆组的表面张力为47.63 m/Nm,对照组的表面张力为48.07 m/Nm。汽爆提取的茶皂素临界胶束浓度值在0.1%左右,对照组在0.5%左右,汽爆提取茶皂素临界胶束浓度值显著低于对照组(P<0.05),说明汽爆提取的茶皂素表面活性比对照组高,这可能与汽爆处理提高了茶皂素得率有关。

图3 汽爆处理对茶皂素表面张力的影响

2.4 汽爆处理对茶皂素起泡性的影响

起泡性能也是茶皂素表面活性的一个重要指标[28]。由图4可知,静置30 s时汽爆和对照组茶皂素起泡高度均随浓度的升高而增加,分别由0.28、0.53 cm增加到5.7、5.4 cm,两组相比差异不显著(P>0.05)。研究表明,5 min时茶皂素泡沫高度与30 s时泡沫高度的比值可以衡量泡沫的稳定性[28]。由图5结果可知,随着茶皂素浓度的增加,汽爆处理组的比值由77%增加到97%,对照组的比值由83%增加到97%,相比之下汽爆处理组比值增加幅度较大。汽爆处理提取的茶皂素起泡稳定性比对照组低,可能是汽爆处理过程中对茶皂素的结构造成了影响,部分茶皂素水解所致[19]。当稳定性比值超过50%即可定义为相对稳定的状态[29]。从图5结果可以看出,尽管汽爆处理提取的茶皂素起泡能力比未汽爆处理的低,但依然具有较好的泡沫稳定性。

图4 不同处理对茶皂素起泡性的影响

图5 不同处理对茶皂素泡沫稳定性的影响

2.5 汽爆处理对茶皂素乳化性的影响

乳化剂是对乳状液的稳定性起重要作用[30]。茶皂素与其他天然乳化剂相比,可在较低的浓度下形成细小油滴,并在多种环境条件下保持稳定[31]。由图6可知,对照组乳化层在30 min后高度由1.23 cm降到1 cm,而汽爆组乳化层高度由1.33 cm降到1.26 cm,二者相比差异不显著(P>0.05),但汽爆组变化相对较小。乳化层高度变化越小说明汽爆处理的样品乳化能力越强,乳化层高度保持时间的长短可衡量乳化稳定性,时间越长稳定性越好[30]。24 h后汽爆组乳化层高度降到0.6 cm,对照组降到0.47 cm,二者差异不显著(P>0.05)。因此,汽爆处理对茶皂素的乳化性影响较小。

图6 不同处理对茶皂素乳化性的影响

2.6 扫描电镜分析

如图7所示,汽爆处理的油茶籽饼粕结构与对照组相比发生了明显变化。从图7A可以看到未经处理的油茶籽饼粕结构较为完整,表面相对光滑,组织结构比较致密。而经过汽爆处理后(图7B)的油茶籽表面层次增加,表面质地疏松,具有很多孔隙立体网状结构,呈现一定的蜂窝状,相对表面积增大,有利于茶皂素的释放。汽爆处理为瞬时高温高压过程,可以在极短时间内有效地破坏细胞内部组织和细胞壁,从而在细胞表面形成孔隙,有利于茶皂素的提取。这与汽爆能够破坏米糠细胞壁屏障,增加米糠蛋白的释放[32],破坏香菇细胞壁,使香菇体内的多糖、总糖、蛋白质均有所增加的结论是一致的[33]。

图7 油茶籽饼粕结构扫描电子显微镜图

2.7 FTIR分析

汽爆处理和对照组样品的FTIR结果如图8所示,在3000～2700 cm-1附近为饱和C-H的伸缩振动峰,在1750～1600 cm-1附近为C=O的伸缩振动峰,在1460 cm-1处为-CH-的反对称变形振动峰;1262 cm-1处为C-O-H的面内弯曲振动峰,在1077和1046 cm-1处为C-O-C的伸缩振动峰。可见,两组样品与已报道茶皂素的主要特征峰一致[28,34],只是汽爆组在2854 cm-1(C-H对称伸缩振动峰)、1710 cm-1(C=O的伸缩振动峰)、1174 cm-1(C-O-C的伸缩振动峰)和 838 cm-1(C-H面外弯曲振动)处吸收峰有所增强,这可能与部分茶皂素单体在汽爆过程中发生水解有关[19]。

图8 不同处理茶皂素的红外光谱图

2.8 茶皂素的液相色谱-质谱联用分析结果

预实验表明茶皂素在阴离子模式下峰形清晰,由此选择阴离子模式便于后续分析。利用液质联用仪对提取的茶皂素化学组成进行定性分析,结果如图9所示。从9B图中可以看出茶皂素主要有三个离子峰,将三个离子峰定位在液相图9A时,刚好有三个吸收峰即1、2、3,可推测出茶皂素中有三个单体。1、2、3三个组分的质谱图分别为图9C、D、E。从阴离子质谱图中可知,组分1的[M-H]-为1097.2138,可知分子量为1097,推测其分子式可能为C54H82O23,与Morikawa等[35]结果对比,推测组分1可能为茶皂素E13。组分2的[M-H]-为1231.5456,可知分子量为1231,推测其分子式可能为C59H91O26,与Fu等[36]研究结果一致,皂素2可能为油茶皂苷D5。组分3的[M-H]-为1189.5455,可知分子量为1189,推测其分子式可能为C57H89O26,由Morikawa等[37]和Yoshikawa等[38]的研究结果可知,皂素3可能为茶皂素B5或C1。由于本研究未做核磁共振分析,茶皂素精确结构有待于下一步研究确定。

图9 茶皂素化学组成的液质联用仪分析结果

3 结论

汽爆预处理明显提高了油茶籽饼粕中茶皂素的提取率和表面活性,降低了茶皂素的表面张力和起泡性,汽爆处理对茶皂素乳化性影响较小。扫描电镜结果表明,汽爆处理使茶籽粕的表面变得粗糙疏松,油茶籽饼粕微观结构遭到破坏,有利于茶皂素从细胞中释放出来,进而缩短了茶皂素的提取时间,提高了茶皂素的得率。FTIR结果表明,汽爆处理的茶皂素部分峰形出现了增强现象,表明汽爆处理对茶皂素结构会产生影响。液质结果显示,茶皂素含有3种单体,对比已报道数据推测其可能是茶皂素E13、油茶皂苷D5、茶皂素B5或茶皂素C1。因此,汽爆预处理油茶籽粕可明显提高茶皂素的提取率,改变茶皂素的部分理化性质。