响应面法优化胡麻籽饼粕黄酮提取工艺及抗氧化活性的研究

米 智， 刘荔贞， 李 慧， 张弘弛

(山西大同大学生命科学学院1，大同 037009)(山西大同大学化学与化工学院2，大同 037009)

胡麻是亚麻的俗称，属亚麻科(Linaceae)亚麻属(Linum)普通亚麻种群(LinumusitatissmumL.)，一年生或多年生，自花授粉二倍体草本植物[1]，广泛用于油脂、纺织、印刷、制革、医药、食品等行业，具有良好的经济价值。胡麻籽的营养成分主要是油脂(30%～40%)和蛋白质(约20%)，以及一定量的矿物质、木酚素、亚麻籽胶、维生素和有毒因子或抗营养因子生氰糖苷、抗VB6因子、植酸等。胡麻籽的各种成分决定了其具有各种各样的生理功能，如抗炎[2,3]、降血脂和降胆固醇[4]、增强胰岛素功能及防治糖尿病[5]、肾损伤保护与辅助治疗[6]、降低慢性疾病如肥胖风险[7,8]、以及抑制癌症的产生与转移[9]等。

亚麻籽粕是亚麻籽经过除杂、预处理、脱皮、翻炒(75～80 ℃，60 min)、压榨、溶剂浸提(50～60 ℃，90 min)、脱溶/烘干、干燥/冷却获得，而亚麻籽饼是只经过压榨不经浸提[10]，很多文献中指亚麻经过溶剂浸提或机械压榨取油后的残余物经粉碎或压片处理后即为亚麻籽饼粕。

胡麻籽饼粕营养物质含量丰富[11]，如粗蛋白[12]、脂肪、无氮浸出物、纤维素[13]等可作为牲畜的饲料，也是加工配合饲料的重要原料。胡麻籽饼粕含有氮、磷、钾三种营养成分，经过沤制发酵，是农作物的优质有机肥料，但因其含有抗营养因子和有毒成分而大部分被丢弃，造成资源浪费。胡麻籽饼粕进行酶解可获得多种生物活性的肽，具有抗氧化、抗病毒、抗高血压、激素调节、免疫调节等作用[14]。含有活性成分α-亚麻酸[14]、脂肪酸[15]、木酚素[16]、亚麻籽胶[17]、黄酮[18]等。亚麻籽饼粕不仅能够为人和动物提供营养物质，还具有抗炎、抗癌、调节血脂等多种有益作用[19]。

目前，胡麻籽饼粕中的蛋白提取工艺及功能报道较多，而对其黄酮提取工艺及抗氧化性研究报道较少；同时基于索氏提取工艺的优点，结合乙醇有机溶剂无毒、沸点低、回收方便等特点、适于索氏提取法进行胡麻籽饼粕中黄酮的提取，有利于降低生产成本，提高效率等[20]。

本实验以压榨取油后的胡麻籽饼粕为研究对象，通过单因素实验与响应面分析的方法，优化索氏提取法提取胡麻籽饼粕黄酮的最佳工艺条件，并采用清除DPPH、ABTS自由基的方法测定其抗氧化活性，以期为胡麻籽饼粕黄酮的提取及其高值化综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡麻籽饼粕；芦丁标准品、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2，2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和维生素C(VC)、K2S2O8、C2H5OH、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TLSE-02型索氏提取器，BSA323S精密电子天平，台式DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱，SXKW-1 000 mL数显控温电热套，800Y万能粉碎机，JC-UT2000型紫外/可见分光光度计，QYRE-2A旋转蒸发仪，JC-16GT高速冷冻离心机等。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的建立

精确称取芦丁标准品10 mg，加少许无水乙醇，在超声波辅助下，摇匀使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL芦丁标准液[21]，参照米智等[20]方法制作芦丁标准曲线。

1.3.2 胡麻籽饼粕黄酮提取工艺流程

胡麻籽饼粕处理：胡麻经过100～110 ℃翻炒10 min后，经过机械压榨取油后即为胡麻籽饼粕。石油醚将其脱脂后，50～55 ℃烘干，粉碎过60目筛，干燥保存待用。

黄酮提取工艺流程：处理后的胡麻籽饼粕→称重→分/包装→浸提→定容→测定→计算。

1.3.3 胡麻籽饼粕黄酮的测定方法

精确量取1 mL浸提液做为待测液，同1.3.1，做3组平行实验求平均值，代入线性回归方程，得到胡麻籽饼粕黄酮的含量。

胡麻籽饼粕黄酮提取量(mg/100 g)=

式中：C为胡麻籽饼粕黄酮质量浓度mg/mL；N为稀释的倍数；V为提取液总体积/mL；W为样品的质量/g。

1.3.4 胡麻籽饼粕黄酮提取工艺的单因素实验

1.3.4.1 提取时间

准确称取处理后胡麻籽饼粕粉末2 g，在乙醇体积分数为60%、料液比(g∶mL)为1∶25，设置提取时间为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h提取胡麻籽饼粕中总黄酮，测定提取液吸光值并计算黄酮提取量。

1.3.4.2 乙醇浓度

准确称取处理后胡麻籽饼粕粉末2 g，在料液比(g∶mL)为1∶25、提取时间为2 h，设置乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%提取胡麻籽饼粕中总黄酮，测定提取液吸光值并计算黄酮提取量。

1.3.4.3 料液比

准确称取处理后胡麻籽饼粕粉末2 g，在乙醇体积分数为60%、提取时间为2 h，设置料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g∶mL)提取胡麻籽饼粕中总黄酮，测定提取液吸光值并计算黄酮提取量。

1.3.5 响应面实验设计及统计学分析

根据胡麻籽饼粕黄酮提取工艺的单因素实验结果，从提取时间(A)、乙醇浓度(B)和料液比(C)3个因素中，分别选取3个对胡麻籽饼粕黄酮提取量影响较大的水平，以黄酮提取量为考察目标，运用Design-Expert V8.0.6.1软件进行响应面实验设计，根据Box-Behnken中心组合设计原理，确定相应面试验方案，并建立回归方程预测模型确定最佳提取工艺参数。

1.3.6 胡麻籽饼粕黄酮提取工艺的验证性实验

为了更好的验证索氏提取法提取胡麻籽饼粕黄酮的可靠性和合理性，在响应面实验结果的基础上，进行了3次平行验证性实验，并计算相对标准偏差(RSD)。

1.3.7 胡麻籽饼粕黄酮抗氧化性测定

1.3.7.1 胡麻籽饼粕黄酮对DPPH自由基清除能力测定

根据响应面试验最优条件下提取胡麻籽饼粕黄酮提取液，进行适当浓缩，用无水乙醇配制成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2 mg/mL的样品溶液，分别精确量取以上溶液0.6 mL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液2.4 mL，混匀，在黑暗中室温下反应40 min后，在517 nm处测定吸光值[22,23]。用VC为本实验的参照物，以半数清除率IC50值作为抗氧化活性评价指标，按照公式计算清除率。

DPPH自由基清除率=(A对照-A样品+A空白)/A对照×100%

式中：A对照为0.6 mL无水乙醇+2.4 mL DPPH溶液；A样本为0.6 mL胡麻籽饼粕黄酮待测液+2.4 mL DPPH溶液；A空白为0.6 mL胡麻籽饼粕黄酮待测液+2.4 mL无水乙醇。

1.3.7.2 胡麻籽饼粕黄酮对ABTS自由基清除能力测定

量取7 mmol/L的 ABTS溶液与2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等体积混匀，室温且避光条件下反应12～16 h，形成ABTS自由基离子(ABTS+·)储备液。测试前，将ABTS+·储备液用无水乙醇稀释至在734 nm波长下的吸光值为0.70±0.02，作为ABTS+·工作液保存于30 ℃待用。取胡麻籽饼粕黄酮浓缩液，用无水乙醇配制成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2 mg/mL的样品溶液，分别精确量取以上溶液1 mL，加入ABTS+·工作液6 mL，混匀，在黑暗中30 ℃下反应30 min后，在734 nm处测定吸光值[24,25]。以VC作为本实验的参照物，以半数清除率IC50值作为抗氧化活性评价指标，按照公式计算清除率。

ABTS自由基清除率=(A对照-A样品+A空白)/A对照×100%

式中：A对照为1 mL去离子水+6 mL ABTS工作液；A样本为1 mL胡麻籽饼粕黄酮待测液+6 mL ABTS工作液；A空白为1 mL胡麻籽饼粕黄酮待测液+6 mL去离子水。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以不同浓度芦丁(C，mg/mL)为横坐标，OD510吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程为：y=9.25 6x-0.312，R2=0.992。

2.2 胡麻籽饼粕黄酮提取工艺的单因素实验结果

由图1可知，随着提取时间的延长，胡麻籽饼粕黄酮提取量逐渐升高，并在2.5 h时黄酮含量达到了最高值，约为20.1 mg/100 g，当提取时间再延长，黄酮提取量略有下降。在做响应面实验时，选取提取时间为2.0、2.5、3.0 h作为3个水平。

胡麻籽饼粕黄酮提取量随着乙醇体积分数的升高而增加，并在60%时黄酮提取量达到最大值，约为21.6 mg/100 g，当乙醇浓度再升高时，胡麻籽饼粕黄酮量反而有所降低。响应面实验选取乙醇体积分数为50%、60%、70% 3个水平。

胡麻籽饼粕黄酮的提取量随着料液比的增大而增加，并在1∶25时达到最大值，约为21.8 mg/100 g，当料液比再增大时，胡麻籽饼粕黄酮提取量反而降低。在做响应面实验时，选取料液比为1∶20、1∶25、1∶30三个水平。

2.3 回归模型的建立及其分析

响应面分析因素与水平见表1。响应面实验方案与结果见表2。

表1 响应面分析因素与水平

表2 响应面实验方案与结果

建立胡麻籽饼粕黄酮提取工艺参数的回归模型，获得本实验评价指标(胡麻籽饼粕黄酮提取量)的响应值(Y/mg/100 g)对自变量A(提取时间)、B(乙醇浓度)和C(料液比)的二次多项式回归方程：胡麻籽饼粕黄酮提取量(Y/mg/100 g)=-80.175+16.55A+1.617 5B+2.66C+0.135AB-0.09AC+5.5E-3BC-4.35A2-0.0173 75B2-0.055 5C2。

回归模型方差分析见表3。以胡麻籽饼粕黄酮提取量为评价指标对该模型进行方差分析及模型系数进行显著性检验(表3)。回归模型在统计学上呈极显著(P<0.01)，说明实验模型有统计学意义；且通过P值可知模型中变量A、AB、A2、B2和C2对黄酮提取量影响极显著(P<0.01)，BC项对黄酮提取量影响显著(P<0.05)，说明实验因素与响应值不是简单的线性关系，一次项、二次项、AB和BC的交互作

表3 回归模型方差分析

通过三维响应面图和二维等高线图分析显示，随着提取时间、乙醇浓度和料液比的增大或延长，胡麻籽饼粕黄酮的提取量也随之增大，但当提取时间、乙醇浓度和料液比增大或延长到一定程度后，黄酮提取量有下降的趋势。提取时间和乙醇浓度的交互作用对模型影响极显著，乙醇浓度和料液比的交互作用对模型影响显著，从等高线图中可见其椭圆程度和疏密程度，与模型回归中的方差分析一致。

2.4 最佳提取条件的确定

由响应面软件分析可得索氏提取胡麻籽饼粕黄酮的最佳工艺：提取时间为2.58 h、乙醇体积分数为60.52%、料液比为1∶24.86，最高提取量为23.23 mg/100 g。考虑实验操作的简便性，修正提取工艺条件提取时间为2.5 h、乙醇体积分数为60%和料液比为1∶25。

2.5 优化条件的验证性实验

根据响应面实验优化出胡麻籽饼粕黄酮提取最佳工艺，进行3组平行实验，验证响应面实验结果的可靠性和准确性。验证性实验测定胡麻籽饼粕黄酮提取量见表4。3组平行样数据的RSD为0.95%，满足要求，得出该提取工艺下胡麻籽饼粕黄酮提取量较为稳定。

表4 验证性实验测定胡麻籽饼粕黄酮提取量

2.6 胡麻籽饼粕黄酮抗氧化性测定

2.6.1 胡麻籽饼粕黄酮对DPPH自由基清除能力测定

由图2可知，在测定浓度范围内，VC和胡麻籽饼粕黄酮清除DPPH自由基的能力逐渐增大，与浓度成一定的量效关系。在0.1 mg/mL处，胡麻籽饼粕黄酮清除率为76.94%，该浓度下VC的清除率为96.63%。胡麻籽饼粕黄酮和VC对DPPH自由基清除率的IC50值分别为0.057和0.024 mg/mL，说明胡麻籽饼粕黄酮具有一定清除DPPH自由基的能力。

图2 胡麻籽饼粕黄酮和VC对DPPH自由基的清除率

2.6.2 胡麻籽饼粕黄酮对ABTS自由基清除能力测定

由图3可知，在测定浓度范围内，胡麻籽饼粕黄酮对ABTS自由基清除能力逐渐加强，且与VC变化趋势较一致。在0.1 mg/mL时，胡麻籽饼粕黄酮清除率达到76.89%，该浓度下VC清除率为91.58%。胡麻籽饼粕黄酮和VC对ABTS自由基清除率的IC50值分别为0.059、0.034 mg/mL，说明胡麻籽饼粕黄酮具有一定清除DPPH自由基的能力。

图3 胡麻籽饼粕黄酮和VC对ABTS自由基的清除率

3 结论

本研究采用索氏提取法，采用单因素和响应面实验优化胡麻籽饼粕黄酮提取工艺，在提取时间为2.5 h，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶25时，胡麻籽饼粕黄酮提取量最大，约为21.9 7 mg/100 g。通过方差分析可知，提取时间、提取时间与乙醇浓度交互项对胡麻籽饼粕黄酮提取量影响均极显著(P<0.01)，乙醇浓度和料液比交互项对胡麻籽饼粕黄酮提取量影响显著(P<0.05)。通过验证实验可得，该工艺下胡麻籽饼粕黄酮提取量最高，相对标准偏差较小(RSD)，约为0.95%。通过抗氧化性测定可得，胡麻籽饼粕黄酮和VC对DPPH自由基清除率的IC值分别为0.057、0.024 mg/mL；对ABTS自由基清除率的IC值分别为0.059、0.034 mg/mL，尽管胡麻籽饼粕黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除率稍弱于VC，但是对其均有一定的清除能力。