奶粉中OPO含量的气相色谱检测技术研究

木其尔,郑晓玮,2,杨春雪,夏欣然,崔亚娟,*

(1.北京市营养源研究所,北京 100069;2.北京城市学院,北京 100083)

1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(1.3-Dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride;OPO)是婴幼儿营养补充剂,是棕榈酸酯化在甘油三酯的Sn-2位置,油酸在Sn-1和Sn-3位置二位脂肪酸。具有高含量的Sn-2位棕榈酸,可以促进脂肪的吸收,提高脂肪酸的消化率和吸收率,减少脂肪酸皂的形成,促进对钙的吸收[1～3]。OPO添加到婴儿配方奶粉中可增加其Sn-2位棕榈酸的含量,脂肪酸组成和位置分布上模仿母乳脂肪,减少婴幼儿便秘和排便困难,提高婴幼儿对于能量和矿物质的吸收和利用,减少体内钙、镁等骨骼矿物质及其他营养成分的流失,改善婴儿配方乳粉对婴儿钙质和能量摄入不足的症状,激活免疫细胞,提高婴幼儿自然抵抗力[4-7]。

OPO作为一种营养强化剂广泛应用到婴幼儿乳粉的配方中,也有大量添加OPO的婴幼儿配方奶粉正在市场上流通,是一种炙手可热的产品[8-10]。2008年中华人民共和国卫生部公告(2008年第13号公告)批准了OPO作为营养强化剂可添加到婴儿配方奶粉中[11]。2013年1月1日颁布的GB 14880-2012《食品营养强化剂使用标准》中明确规定了OPO在婴儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品等方面的限量要求[12]。然而目前在国内尚无奶粉中OPO的检测国标方法,《GB 30604-2015食品营养强化剂1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯》[13]标准仅适用于以食用植物油与油酸(来源于食用植物油脂)为原料的样品测定,不适用于测定婴幼儿配方乳粉的OPO含量。无法衡量乳粉中OPO添加量及添加范围是否合理安全等问题。

目前针对奶粉中OPO含量的研究也有文献检测方法,如正相液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、银离子交换柱液相色谱法[14-25]等。气相色谱-质谱及蒸发光检测器-高效液相法仪器复杂，影响因素较多，测定时间较长,前处理复杂,银离子交换柱使用频率不宜多,容易受一些溶剂的影响,条件太过局限,成本高。本研究将选用DB-1H耐高温色谱柱建立前处理较简单、易操作,使用试剂用量少、测定时间较短,气相条件稳定,能够准确测定奶粉中OPO含量的方法。该方法的建立将可将更加准确定量奶粉中OPO的含量,为国标方法的研制提供依据,为企业、科研机构的科学研究和质量控制提供方法保障,给相关科研检测机构和监管部门提供技术支持,具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂奶粉(空白样品) 玛氏企业;西悦茗星婴儿配方奶粉(0～6月)、较大婴儿配方奶粉(6～12月)、幼儿配方奶粉(12～36月) 西牧乳业;OPO(10 mg,纯度≥99%)、十七碳酸甘油三酯(30 mg,纯度≥99%) 上海安谱实验科技股份公司;氨水 分析纯,北京化工厂;正己烷 色谱纯,Fisher Chemical公司;无水乙醚 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;石油醚、无水乙醇 分析纯,北京市通广精细化工公司。

气相色谱GC-2010 岛津公司;电子天平(万分之一) 北京赛多利斯仪器系统有限公司;RE-2CS旋转蒸发器 东京理化器械珠式会社埃朗科技国际贸易(上海)有限公司;DZKW-6恒温水浴锅(0～100 ℃) 北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 配制2 mg/mL十七碳酸甘油三酯标准溶液作为内标,-20 ℃保存;配制1 mg/mL OPO标准溶液,-20 ℃保存;移取1.0 mL十七碳酸甘油三酯标准溶液、2.0 mL OPO标准溶液于10 mL容量瓶中,配制成0.2 mg/mL混合标准溶液,-20 ℃保存。

1.2.2 标准曲线绘制 准确吸取OPO标准储备溶液(1.0 mg/mL),配制成浓度为100、50、40、20、10、5、1 μg/mL的OPO标准工作液,内标十七碳甘油三酯浓度为206.8 μg/mL,以OPO标准和十七碳甘油三酯浓度比为横坐标,以它们峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 样品前处理 脂肪的提取:准确称取样品1.00 g(精确至0.01 g)至毛氏管中,粉末及固体样品加入10 mL(65±1) ℃水溶解,振摇,使样品完全分散,加入2 mL十七碳酸甘油三酯内标和2 mL氨水,于(65±1) ℃恒温水浴中放置15 min,取出轻摇,冷却至室温。在冷却后的样品液中加入10 mL乙醇,混匀,加入25 mL乙醚,加塞振摇1 min,再加入25 mL石油醚,加塞振摇1 min,静置、分层,小心将有机层转入250 mL三角瓶中。再重复用乙醚、石油醚提取操作一次,合并提取液,一并转入三角瓶中,在60 ℃下用旋转蒸发仪减压浓缩至干。

测定液的制备:正己烷充分溶解上述脂肪提取物,并定容至20 mL,涡旋混匀后取1～2 mL过0.22 μm的有机系微孔滤膜,滤液供气相色谱分析。

1.3 色谱条件

色谱柱:100%-二甲基聚硅氧烷非极性色谱柱(DB-23,柱长60 m、内径0.32 mm、膜厚0.17 μm,40～250 ℃);5%-二苯基95%-二甲基聚硅氧烷弱极性毛细管柱(HP-5,柱长25 m、内径0.32 mm、膜厚0.17 μm,60～325 ℃);100%二甲基聚硅氧烷耐高温色谱柱(DB-1HT,柱长30 m、内径0.25 mm、膜厚0.1 μm,60～400 ℃)。

进样口温度:320 ℃;检测器温度:380 ℃;程序升温:300 ℃,保持3.0 min,以20/min的速率升温至380 ℃,保持10 min;载气:氮气,恒压模式;进样体积:1.0 μL;分离度应大于1.5;氢气与空气的流量比:40∶400。

1.4 OPO含量的计算

式中:A1:试样溶液中OPO的峰面积;A2:试样溶液中十七碳甘油三酯的峰面积;C:十七碳甘油三酯的浓度(mg/mL);V:试样溶液中加入十七碳甘油三酯的体积(mL);m:试样的质量(mg);f:OPO的校正因子。

式中:Ao:混合标准溶液中OPO峰面积;Cn:混合标准溶液中十七碳酸甘油三酯的浓度(mg/mL);An:混合标准溶液中十七碳酸甘油三酯的峰面积;Co:混合标准溶液中OPO的浓度(mg/mL)。

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择及色谱条件的确定

分别采用安捷伦DB-23、HP-5、DB-1HT毛细柱对奶粉样品中的OPO进行分离。DB-23为50%氰丙基甲基聚硅氧烷强极性色谱柱,适用于分离脂肪酸甲酯,对顺、反-异构体具有理想的分离度,但是温度上限较低,不适于OPO的分离。HP-5为5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷弱极性毛细管柱,是高性能通用色谱柱、应用范围广、温度上限高,但是无法有效的分离出OPO组分。DB-1HT为100%二甲基聚硅氧烷非极性耐高温色谱柱为经特殊处理将温度上限扩展到400 ℃高温,聚酰亚胺涂层的熔融石英管对高沸点化合物,峰形出色和流出时间更快,键合交联,能较好的分离OPO组分,见图1。结果DB-1HT耐高温色谱柱分离效果较好,适用于乳及乳制品样品OPO含量定性定量分析[26]。

图1 DB-1H柱子分离OPO色谱图

2.2 方法验证

2.2.1 特异性 奶粉样品按照本方法处理,采用气相色谱氢火焰离子化检测器(FID)检测,采集谱图与标准溶液谱图对照,如图2～图4所示,奶粉样品中OPO保留时间为12 min,不受样品本底的干扰,特异性很好。

图2 OPO标准溶液色谱图

图3 奶粉样品色谱图

图4 空白样品色谱图

2.2.2 线性范围 由图5可知,OPO在1～100 μg/mL范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=1.1565x+0.0036,决定系数R2=0.997。

图5 OPO标准曲线

2.2.3 方法定量限 准确称取脱脂奶粉(空白样品)1.00 g(精确至0.01 g)添加200 μg/mL的OPO标准品,前处理后上机,观察信噪比。逐步减少加标浓度恰好至R(S/N)=10时的测定浓度作为定量限,得到方法的定量限(LOQ)为70 μg/mg。当样品最大称样量为10 g,最小定容体积为10 mL时,折算得出方法检出限(LOD)为20 μg/mg。

2.2.4 精密度 取6份西悦茗星婴儿配方奶粉作为实验样品,前处理后连续测定6次(n=6),计算精密度。见表1,测定结果的精密度为1.52%,小于10%,能满足分析的需要。

表1 精密度测定结果

2.2.5 回收率取脱脂奶粉样品,分别添加检出限20 μg/mL、2倍检出限40 μg/mL及自选点50 μg/mL不同质量浓度的标准溶液进行回收率试验,各个水平平行测定3次,扣除空白样品中OPO含量后,计算回收率和相对标准偏差(RSD),结果见表2:OPO三个水平的平均加标回收率在90.0%～96.12%之间,RSD均小于5%,表明该方法比较准确,适用于奶粉中OPO的定性定量分析。

表2 加标回收试验结果

2.2.6 稳定性 将一定浓度的OPO标准品与奶粉样品每1h进样一次,总共进样10次,计算其RSD值,考察10h内的稳定性,结果见表3:标准品及样品RSD分别为0.30%、0.68%,数据重现性较好,方法及仪器条件稳定。

表3 稳定性试验结果

2.2.7 实际样品测定 采用本研究方法检测西悦茗星婴儿(0～6月)、较大婴儿(6～12月)、幼儿(12～36月)三个段位的配方奶粉中OPO的含量。《食品营养强化剂使用标准》中规定婴儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品的限量要求[9]:婴儿配方奶粉OPO含量在3.2～9.6 g/100 g范围,较大婴儿和幼儿配方奶粉在2.4～9.6 g/100 g范围,本次测定结果:西悦茗星婴儿、较大婴儿和幼儿配方奶粉中其OPO含量分别为6.45、4.84和4.44 g/100 g,RSD均小于10%,符合使用标准要求。

表4 样品中OPO含量测定结果

3 结论

本研究采用氢火焰离子化检测器-气相色谱仪对奶粉中的OPO进行检测,结果显示气相色谱法能准确定性定量奶粉中OPO的含量,分离较好,方法重现性良好,稳定性强,精密度RSD为1.52%,回收率为90.00%～96.12%,可满足分析要求;并且测定时间较短、使用试剂量少,前处理方法简单、易操作,气相条件稳定,适用于OPO的快速测定。