芫荽提取物对秀丽隐杆线虫体内抗氧化活性的初步探究

刘 畅,徐 悦,单承莺,朱昌玲,赵 飞,张焕仕,*

(1.南京野生植物综合利用研究院,江苏南京 211100;2.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210023)

芫荽(CoriandrumsativumL.)俗称香菜,属一年或两年生的伞形科草本,是一种药食两用的香料植物。芫荽性温味辛入肺脾经,营养成分丰富、保健功能强,含有多种对人体有益的活性物质,具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗炎症等功能,还有报道称其具解毒的效果[1-2]。近年来,香辛食品植物的抗氧化活性得到了广泛的关注和研究,其中芫荽的抗氧化功能更是成为国内外学者研究的热点[3-5]。目前,芫荽的抗氧化研究大多注重以体外清除自由基活性能力为主[6-7],体内实验还鲜见报道,不利于多方位了解芫荽的生物学功能和潜在开发价值。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)简称线虫,属于线虫动物门小干线虫属,是一种体积小、易饲养且操作简便的模式生物,其神经、消化、生殖系统与哺乳动物具有高度同源性[8-10],受到了遗传学、药理学、发育学和神经生物学等众多生物领域研究者的高度重视,被广泛应用于生物实验的前期探索过程中,是一种可用于物质性质评价和机制探究的经济便捷的模式生物[11-12]。

百草枯(Paraquat,PQ),化学名为1,1′-二甲基4-4′-联吡啶二氯化物,是一种剧毒的非选择接触性季铵类除草剂。PQ毒性损害机制主要包括氧化应激、炎症反应、核转录因子过度表达、凋亡等,其中氧化应激反应在PQ中毒机体损伤中发挥主要作用。PQ作为电子受体可诱导机体产生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成细胞膜脂质过氧化,产生氧化损伤,破坏机体自身氧化物及细胞内防御系统状态平衡[13-14]。因此,本研究用百草枯作为自由基引发剂来探讨秀丽隐杆线虫在氧化胁迫后,芫荽提取物对生物体的抗氧化作用。

在秀丽隐杆线虫中,胰岛素/IGF-1(IIS)信号通路是一条进化上保守的内分泌通路,能够调节各种生物的寿命并让生物在受迫的条件下存活,其中daf-2和daf-16是该信号通路中的两个关键基因[15]。daf-2是哺乳动物胰岛素/IGF受体的同源物,daf-16是FOXO转录因子同系物。激活的daf-2会与INS-7和AGE-1/PI3K/AKT相互作用,从而削弱了daf-16的转录活性。daf-2缺失株会抑制IIS信号通路,促进daf-16的转录水平,从而上调一系列基因的表达,促进滞育期的形成,延长寿命、促进代谢、提高应激反应、天然免疫能力等,daf-2活力的下降可以延长线虫的寿命达一倍[16]。IIS与哺乳动物中的胰岛素信号通路有着高度的相似性,利用秀丽线虫研究该通路在调节碳水化合物代谢以及衰老的机制成为近年来科学家们关注的热点。

本文通过探究芫荽不同部位水提物处理后的秀丽隐杆线虫体内活性氧水平、急性氧损伤的保护作用来评价芫荽的体内抗氧化活性,同时还从基因水平上初步探究芫荽不同部位水提物抗氧化作用发生机制,以期进一步为芫荽的抗氧化活性研究和开发其价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芫荽成熟后期的籽实和茎叶 江苏南京高淳地区,经南京野生植物综合利用研究院肖正春教授鉴定为伞形科芫荽属CoriandrumsativumL.;N2野生型秀丽隐杆线虫、OP50(尿嘧啶渗漏突变型)大肠杆菌 由东南大学惠赠;百草枯 美国Sigma公司;ROS活性氧测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;总RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、SYBR Premix EX Taq(Tli RnaseH Plus)试剂盒 Takara试剂有限公司;其余试剂 均购自国药集团化学试剂有限公司。

FW-100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;JCS-600型电子天平 凯丰集团有限公司;T6紫外/可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;旋转蒸发仪 上海亚荣仪器厂;循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;数显恒温水浴锅 常州天瑞仪器有限公司;奥林巴斯显微镜(Olympus_BX41) 奥林巴斯(中国)有限公司;HCB-1300V洁净工作台 青岛海尔特种电器有限公司;JW-2017HR高速冷冻离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司;SPX-150B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;MG96+PCR仪 杭州朗基科学仪器有限公司;Biosens SC810凝胶成像系统 上海山富科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芫荽提取物制备 提取方法参考文献[17-18],芫荽籽和茎叶洗净,置于常温中自然晾干。粉碎芫荽籽和茎叶后过40目筛,分别以蒸馏水煮籽粉末和茎叶,料液比为1∶10 g/mL,煮沸水提3 h,过滤后得滤液,再经减压浓缩、干燥得各自水提物浸膏。以蒸馏水复配得水提液备用。

1.2.2 NGM培养基的配制 在975 mL蒸馏水中分别加入3 g氯化钠、2.5 g多聚蛋白胨和17 g琼脂粉,高压蒸汽灭菌,取出后放置于超净工作台中,向溶液中分别加入1 mL 1 mol/L氯化钙溶液、1 mL 1 mol/L硫酸镁溶液以及25 mL 0.1 mol/L磷酸钾溶液,混匀,待溶液冷却至50 ℃时再加入1 mL 5 mg/L胆固醇,摇晃均匀后倒入无菌培养皿中,备用。

1.2.3 秀丽隐杆线虫同步化处理 同步化方法参考文献[19],以LB液体培养基活化OP50大肠杆菌,然后将108CFU/mL菌液以1/2培养皿半径于培养基中心处涂布画圆,在超净工作台内自然风干后使用。正常培养的线虫在成虫后通过显微镜观察可见其体内的虫卵,当一块培养基上大多数线虫体内有虫卵时可进行同步化。用M9缓冲液将线虫冲洗收集至无菌EP管中,待虫体沉降至管底时加入缓冲液反复洗涤至溶液无明显浑浊,去上清,再加入1 mL裂解液(1 mol/L NaOH与2.5%(V/V)NaClO等比混合,现配现用),立即混匀,上下倒颠5 min后4000 r/min离心1 min,留沉淀,加入M9缓冲液,再离心,重复3次,最后把沉淀移至新的NGM培养基上,20 ℃培养48 h后得L4期线虫。

1.2.4 秀丽隐杆线虫暴露方法 分别制备芫荽籽和茎叶水提物溶液,设置浓度为0.1、1、10 mg/mL。取同步化后L4期成虫分别以不同浓度的两种水提物溶液处理线虫24 h后,分别将其以M9缓冲液冲洗收集在无菌EP管中,反复洗涤直至上清液无浑浊。

1.2.5 体内ROS活性氧水平 取同步化并暴露过的线虫,按照ROS活性氧试剂盒操作说明配试剂、处理线虫4 h后,用激光扫描共聚焦显微镜观察线虫体内产生的荧光强度,并拍照记录,激发波长488 nm,测量波长510 nm。

1.2.6 百草枯急性氧损伤实验 不同浓度芫荽水提物暴露后的线虫去除上清液,放入96孔板中每孔10条,分别加入40 μL 100 mmol/L百草枯溶液,20 ℃环境下处理6 h后计数每孔中存活着的线虫个数,各浓度三个平行,实验重复三次,计算存活率,取平均值[20]。

存活率(%)=存活条数/总条数×100

1.2.7 逆转录及实时定量PCR

1.2.7.1 引物设计 参照Wormbase上线虫胰岛素信号通路上的基因序列,使用Primer软件设计了actin-1、daf-2和daf-16三个基因的引物特异性序列,其中actin-1为管家基因。daf-2作为胰岛素受体同源物定位于细胞膜上,是线虫中表达胰岛素受体家族的唯一成员,与细胞胞外类似胰岛素配体结合后,会使得一系列信号级联反应在细胞内发生,最终通过磷酸化daf-16达到抑制其进入细胞核发挥转录调节功能,从而延长动物的寿命。引物序列具体见表1。

表1 实时定量PCR引物序列

1.2.7.2 总RNA提取 按照试剂盒说明称取1.2.4暴露处理后的10 mg/mL秀丽隐杆线虫若干,以M9缓冲液处理后的线虫为空白对照,提取的总RNA以RNase Free蒸馏水溶解,提取的RNA纯度和浓度根据OD260/280比值判断。

1.2.7.3 cDNA合成及实时定量PCR 取1.2.7.2实验所得总RNA提取液,按照试剂盒说明在超净工作台中进行冰上操作,所需用具均需要经过灭菌处理。cDNA合成具体反应体系如表2,实时定量PCR反应体系具体如表3,基因最终表达结果以目标基因与管家基因的比值来表示。反转录和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的程序设计为:按照12.5 μL中625 ng总RNA,40 mol/L逆转录引物,4000 mol/L Tris-HCl,6000 mol/L KCl,240 mol/L MgCl2,800 mol/L二硫苏糖醇,20 U RNA酶抑制剂和100 U逆转录酶混合,在25 ℃孵育5 min和42 ℃孵育60 min后,逆转录酶灭活70 ℃ 15 min,-20 ℃保存备用。按照cDNA 1 μL,SYBR Green I Master Mix 8 μL,SYBR Green I Master Plus 2 μL,forward primer 1.2 μL,reserse primer 1.2 μL,H2O 6.6 μL的构成配成20 μL体系,ABI 7500实时PCR仪上94 ℃预变性5 min,94 ℃ 30 s,特定温度退火30 s,72 ℃延伸30 s并采集荧光信号,共进行40个循环。以比较域值法测定目的基因相对表达水平,以内参(act-1)做均一化处理,实验组和对照组的ΔCt=Ct目的-Ct内参,表示目的基因相当于内参表达的比例;ΔΔCt=ΔCt暴露组-ΔCt对照组,以2-ΔΔCt±S.D可反映剂量组与对照组目的基因表达的差异(倍数)。

表2 cDNA反应体系

表3 实时定量PCR

1.3 数据处理

荧光强度分析使用Image J图像软件,实验数据使用SPSS 17.0软件处理并进行统计学方差分析,显著水平0.05与0.01代表统计分析上的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 秀丽隐杆线虫体内ROS水平

ROS与各种疾病,包括急性中毒、心血管疾病、炎症、各种病毒性损伤、药物性组织损伤、高血压等的病理过程以及衰老的生理变化密切相关。过量的ROS会破坏机体氧化系统和抗氧化系统的平衡状态,导致组织细胞脂质过氧化、蛋白质损伤、DNA断裂等,需要使用抗氧化剂和自由基清除剂来减轻或阻止机体损伤。DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检测探针。进入细胞后DCFH-DA被酯酶水解为DCFH,活性氧会将其氧化为DCF,这是一种不能透过细胞膜的强绿色荧光物质,其荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。

如图1所示,与空白对照组相比,经过不同浓度的芫荽籽水提物处理后线虫体内荧光强度呈现明显减弱,说明线虫体内活性氧水平下降。随着芫荽籽水提物浓度的逐渐增大,线虫体内荧光强度不断下降,当浓度达到10 mg/mL时,荧光强度最暗,说明芫荽籽的水提物能够有效的降低秀丽隐杆线虫体内ROS水平。

图1 芫荽籽水提物对线虫体内活性氧水平的影响

芫荽茎叶水提物对线虫的作用结果如图2,与对照相比,茎叶水提物处理后的线虫体内荧光强度也发生明显减弱的趋势,随着浓度增加,荧光强度逐渐减弱,最大浓度10 mg/mL处理时荧光强度最弱,由此可以说明芫荽茎叶水提物也有降低线虫体内ROS活性氧水平的作用。

图2 芫荽茎叶水提物对线虫活性氧水平的影响

2.2 PQ对秀丽隐杆线虫存活率的影响

氧化应激是PQ损伤的主要机制,通过体外运用具有抗氧化作用的芫荽水提物可明显减轻PQ诱导的氧化损伤。由图3可知,对照组线虫经PQ损伤6 h后存活率为57.78%±1.92%,而经0.1、1、10 mg/mL的芫荽籽水提物处理后,线虫的存活率均极显著增加(P<0.01),分别为71.11%±1.92%、86.67%±3.33%和87.78%±6.94%,且随着处理浓度的增加,秀丽隐杆线虫的存活率呈正相关增长趋势。

图3 不同浓度芫荽籽水提物对百草枯诱导线虫存活率的影响

芫荽茎叶水提物处理后的线虫见图4,在浓度为0.1 mg/mL时存活率与对照组差异不显著,当浓度为1、10 mg/mL时存活率出现显著上升(P<0.05),存活率最大达到78.89%±5.09%。由此可见,芫荽籽和茎叶水提物在PQ损伤中均能够发挥保护作用,其中芫荽籽水提物效果更佳,在较低浓度下(0.1 mg/mL)就能起防护功效。

图4 不同浓度芫荽茎叶水提物对百草枯诱导线虫存活率的影响

2.3 秀丽隐杆线虫体内胰岛素信号途径抗氧化基因的表达

秀丽隐杆线虫生理指标的影响与胰岛素/IGF-1(IIS)信号通路密切相关[21-22],IIS信号通路的减弱会导致线虫寿命的延长、天然免疫系统和氧化应激能力的增强,这些表型的适应依赖于daf-16的激活,该转录因子促进了一系列与线虫生长发育相关基因的表达[23-25]。实验选用10 mg/mL芫荽水提物处理后的线虫探究基因daf-2和daf-16是否发挥作用。

由图5可知,经过10 mg/mL芫荽籽和茎叶水提物处理后,线虫中daf-2基因表达水平均极显著降低(P<0.01),线虫体内氧化衰老有关的IIS信号通路daf-2表达下调,会调控daf-16基因表达表达量升高,与本实验结果趋势相吻合。因此,初步推测芫荽水提物在线虫体内表现出的抗氧化效果可能是daf-2和daf-16基因相互作用的结果。

图5 芫荽水提物对胰岛素信号通路目标基因表达的影响

3 讨论与结论

本文以秀丽隐杆线虫为模型探究芫荽两种不同部位水提物的体内抗氧化作用。正常的生理状态下,生物体内ROS处于产生与清除的动态平衡,适量的ROS不会对机体造成损伤,但过多的ROS就会对机体代谢产生干扰,引起各种慢性疾病和衰老[26]。芫荽水提物可以显著减少线虫体内ROS的积累,具有良好的体内抗氧化活性。PQ引起线虫体内急性氧化应激结果表明,经过芫荽水提物前处理的线虫在PQ环境下的生存率明显高于空白对照组,提高秀丽隐杆线虫的寿命。已有报道表明芫荽提取物具有良好的体外抗氧化效果[18],本文通过体内抗氧化生理实验也取得了一致的结论,由此充分证实芫荽能够有效抵御氧化伤害。

基因daf-2和daf-16在线虫胰岛素信号途径起着至关重要地位,对线虫的抗衰老和延长寿命发挥着关键作用[27]。Libina等[28]发现胰岛素蛋白既可以使daf-16-生殖细胞缺陷型线虫的寿命恢复到正常水平,同时还能大幅度提升daf-16-胰岛素途径线虫突变株的寿命长度,实验表明抑制daf-2或激活daf-16,从而平衡和调整下游基因的表达来延缓线虫体内衰老的速率。本实验探究10 mg/L芫荽水提物处理后,发现线虫胰岛素信号途径中daf-2表达量的下降促进了daf-16基因表达量的显著提高,可推测芫荽籽和成熟茎叶水提物对线虫的抗氧化保护作用与这两种基因的调控表达密切相关,具体作用机制还需要进一步深入研究。