红曲菌发酵辣木叶颗粒剂制备工艺及其抗氧化活性的研究

张文州,彭 飞,林水森,庄月娥,陈琳琳,谢志新

(泉州医学高等专科学校,福建泉州 362000)

辣木(MoringaoleiferaLam.)又称鼓槌树,是一种重要的经济植物,其整株可供食用和药用,被广泛应用于药品、保健品、食品、化妆品等领域[1-4]。自从2012年我国卫生部将辣木叶作为新资源食品以来,我国辣木种植、产品研发及销售等均取得很大的发展,目前已有的辣木产品包括辣木叶片剂、辣木罐头、辣木面包和辣木强化食品等,极大丰富了辣木资源的应用[5-6]。

辣木叶作为辣木资源之一,具有不耐贮藏、口感不佳、服用不方便等缺点。本研究从微生物角度出发,考虑到将微生物和辣木叶相结合的方式,对其发酵产物进行深加工,为辣木产品开发提供了新思路。在众多发酵菌种里,红曲菌因代谢产物丰富、营养价值极高,产生的红曲色素、多酚类等产物具有较强的抗氧化活性等优势常被广泛应用于许多领域[7-12]。Wang等[13]利用番石榴叶、卢绍闯等[14]利用紫苏,其他学者利用黄精、大豆等材料作为研究对象和红曲菌进行发酵[15-17]。红曲菌的发酵产物莫纳可林K(Monacolin K,MK)具有良好的降血脂、降胆固醇等功效,Zhang等[18]研究了谷氨酸对不同红曲菌发酵生产MK的影响,Huang等[19]研究了突变和温度等条件对红曲菌产MK的影响以及相关性分析,Kitisart[20]系统研究了乙醇浓度对MK产量以及对抗氧化活性的影响,Liu等[21]基于转录组研究分析了红曲菌合成MK和色素的机制。但红曲菌发酵过程容易产生桔霉素,它是一种真菌毒素,具有显著的致癌、致畸、引发各类疾病的危害,国外一些国家将红曲菌发酵产品中的桔霉素含量作为严格控制指标,从而保证红曲产品食用和药用的安全性[22-24]。

因此,本研究拟使用红曲菌发酵作为辣木叶的加工方式,针对红曲菌发酵辣木叶过程的各因素进行试验优化,并进一步将发酵产物制备成颗粒剂。通过测定产品的抗氧化活性和桔霉素含量评价产品质量,以期有效地解决辣木叶存在的问题,便于直接服用和冲泡,同时又丰富了辣木叶的应用范围,为辣木的产业化应用提供了一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫色红曲菌YGZ-101 福建微生物研究所提供;辣木叶 采自永春县,由泉州医学高等专科学校中药教师林水花鉴定;大米 市售;乙腈(色谱纯)、氯化钙、琼脂、冰醋酸、磷酸二氢铵、MgSO4·7H2O、抗坏血酸、无水乙醇、Tris-HCl缓冲液、葡萄糖、蛋白胨(均为分析纯) 西陇化工有限公司;洛伐他汀(色谱纯) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;菌种活化培养基:马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基 杭州天和微生物试剂有限公司;种子培养基:葡萄糖50 g,蛋白胨10 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NH4H2PO42 g,CaCl20.1 g,定容至1000 mL,pH6.0,121 ℃灭菌20 min;红曲菌液体培养基:葡萄糖4%,酵母浸粉1%,蛋白胨2%,pH6.0,121 ℃灭菌20 min。

Agilent 7890A高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司;JA12002电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;EYELA N-1100旋转蒸发仪 上海爱明仪器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环真空式水泵 上海羌强实业发展有限公司;DXF-20D高速万能粉碎机 广州大祥电子机械设备公司;KYC-100B恒温振荡培养箱 上海福玛实验设备有限公司;LHS-100CH恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原材料准备 将辣木叶清理,并用流水洗净后放入60 ℃的烘箱中干燥2 h,使其得到充分的干燥。测干燥后的辣木叶水分含量为6.7l%。经过高速万能粉碎机粉碎,收集辣木叶粉,并过100目筛,4 ℃保存待用。

1.2.2 发酵培养基制备 将大米、辣木叶粉混合物与蒸馏水以2∶1 g/mL的比例装入250 mL三角瓶中,室温浸泡12 h,每瓶装量20 g,蒸馏水10 mL,121 ℃灭菌20 min。

1.2.3 红曲菌发酵辣木叶工艺 大米、辣木叶拌匀→装瓶→灭菌→冷却→接种、发酵→干燥→产品

大米和辣木叶拌匀加入蒸馏水后装入250 mL三角瓶中,室温浸泡12 h,121 ℃灭菌20 min,冷切后于超净工作台接种红曲菌菌悬液(约107cell/mL),置于恒温培养箱中培养20 d后取出干燥,待用。

1.2.4 发酵条件优化的正交试验 依据参考文献[25-28]结果,选取接种量(A)、辣木叶添加量(B)、发酵温度(C)、初始含水量(D)四因素作为红曲菌发酵辣木叶过程的考察因素,设计L9(34)正交试验,以MK的产量作为评价指标,见表1。

表1 正交实验因素与水平表

1.2.5 红曲样品中MK的测定 Monacolin K检测采用HPLC(QB/T 2847-2007)方法,标准曲线线性回归方程:y=46986x-25598,R2=0.9997,其中横坐标为MK的浓度(mg/L),纵坐标为峰面积,R为相关系数。

1.2.6 颗粒剂制备的主要工艺 物料准备→成型工艺的筛选→制软材→制颗粒→干燥→整粒→质量检查→产品。

采用湿法制粒,准确称取红曲菌发酵辣木叶的发酵产物和辅料,混匀,乙醇做润湿剂制软材,利用1号筛制粒,湿颗粒置于60 ℃烘箱烘干燥2 h后过2号筛整粒,得颗粒剂,将制备好的颗粒剂装入自封袋置于干燥器中保存,待用,根据试验要求对颗粒剂进行质量检查。

1.2.7 颗粒剂考察指标的测定及综合评分方法 参照张文州等[29]的方法,对吸湿性、休止角和成型率等考察指标进行测定。采用百分制的综合评分方法对颗粒剂的质量进行考察,其中吸湿性占30分,休止角占30分,成型率占40分,综合评分的分值=(30×最小吸湿率)/吸湿率值+(30×最小休止角)/休止角值+(40×成型率值)/最大成型率。

1.2.8 不同释释剂的选择 参照王秀丽等[30]的研究结果,选取发酵产物:辅料(1∶2)进行单一辅料的筛选,测定成品的吸湿性、休止角和成型率,以综合评分为评价指标,筛选出糊精、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉中的最佳单一辅料,根据最佳单一辅料结果进一步研究确定混合辅料的最佳配比。

1.2.9 单因素实验 根据1.2.8的结果确定乳糖和淀粉作为混合辅料做进一步研究。以综合评分为考察评价标准,发酵产物∶辅料比值设为1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5时,乙醇体积分数为90%,乙醇用量为0.8 mL/g,乳淀比为1∶1;乙醇体积分数设定为60%、70%、80%、90%、100%时,发酵产物∶辅料比值设为1∶1,乙醇用量为0.8 mL/g,乳淀比为1∶1;乙醇用量设为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/g时,发酵产物∶辅料比值设为1∶1,乙醇体积分数为90%,乳淀比为1∶1;混合辅料乳糖和淀粉的配比(乳淀比)设为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1时,发酵产物∶辅料比值设为1∶1,乙醇体积分数为90%,乙醇用量为0.8 mL/g,分别做单因素实验。

1.2.10 正交设计试验优选颗粒剂成型工艺 根据单因素实验结果,选取A(发酵产物∶辅料)、B(乙醇体积分数,%)、C(乙醇用量,mL/g)、D混合辅料乳糖和淀粉的配比(乳淀比)作为考察因素,以综合评分为评价指标,设计L9(34)正交试验,见表2。

表2 正交试验因素与水平表

1.2.11 DPPH自由基清除能力对比 DPPH自由基清除能力的测定方法参照张文州等[31]方法。实验设计以不添加辣木叶的红曲菌发酵大米的产物作为空白对照,比较发酵前后产品的DPPH自由基清除能力,维生素C作为阳性对照,维生素C和发酵前后产品以纯水为溶剂,浓度均配制为0.15 mg/mL。

1.2.12 桔霉素检测 采用HPLC检测桔霉素,检测发酵后产品中的桔霉素含量,以添加桔霉素的发酵样品作为对照,桔青霉素检测参照GB 5009.222-2016方法测定。

1.3 数据处理

实验操作重复3次,采用DPS软件9.01版对实验结果进行处理,并用Tukey法作多重数据比较,进行正交实验方差分析。

2 结果与分析

2.1 红曲菌发酵辣木叶条件正交试验优化结果

根据表3可知,四个因素影响大小为:B>D>A>C,所得最佳的发酵工艺为A3B2C1D2,即接种量8%、辣木叶添加量20%、发酵温度28 ℃、初始含水量40%。因发酵温度C的极差值最小,所以将其作为误差,进行多重数据分析,由表4可知各因素对结果无显著性影响。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

根据最佳工艺条件,即选取接种量8%、辣木叶添加量20%、发酵温度28 ℃、初始含水量40%,MK的产量为6.92 mg/g,说明优选的发酵条件稳定性良好。

2.2 单一辅料筛选结果

从表5结果可知,四种辅料中,吸湿率最低的辅料为乳糖(13.42%),休止角最小的辅料为可溶性淀粉(36.47°),成型率最高的为乳糖(92.63%)。综合评分的结果,乳糖作为辅料的分值最高为99.24分,可溶性淀粉分值第二高为95.32分。因此,选取乳糖和可溶性淀粉作为混合辅料的材料,研究确定最适混合比例。

表5 单一辅料的筛选结果

2.3 单因素实验结果

由表6可知,当发酵产物∶辅料的比值为1∶1时,综合评分最高达98.33分;乙醇体积分数为90%时,分值最高为99.55分;乙醇用量为0.8 mL/g时,综合评分最高为99.28分;乳淀比为1∶1时,综合评分最高。因此,选取各因素综合评分最高的水平作为正交试验的各因素的中间水平,对颗粒剂成型工艺做正交试验优化。

表6 单因素实验结果

2.4 正交试验优选颗粒剂成型工艺结果

正交试验优选颗粒剂成型工艺实验结果如表7所示,各因素影响大小顺序为:A>D>B>C,最佳的发酵工艺为A3B2C3D3,即发酵产物:辅料为1∶1.5、乙醇体积分数90%、乙醇用量0.9 mL/g、乳淀比2∶1。因乙醇用量C的极差值最小,所以将其作为误差,进行多重数据分析,由表8可知各因素对结果无显著性影响。

表7 正交试验结果

表8 方差分析

根据最佳工艺条件,即选取发酵产物:辅料(1∶1.5)、乙醇体积分数(90%)、乙醇用量(0.9 mL/g)、乳淀比(2∶1),结果为吸湿率为13.34%,休止角为31.62°,成型率为92.55%,综合评分为99.72分。所得结果较正交试验最高分数对应的评价指标均有所提高,说明优选的颗粒剂工艺条件稳定可行。

2.5 DPPH自由基清除效果对比

由表9结果可知,添加辣木叶对红曲菌进行发酵,发酵后产品的DPPH自由基清除率达56.69%,均高于对照和未发酵产品,同浓度的维生素C对照液的DPPH自由基清除率为69.27%,高于发酵后产品。发酵产物的DPPH自由基清除率的提高,可能是发酵促进了红曲菌产生了抗氧化的代谢产物,从而提高了发酵后产品的抗氧化效果,这与Qin等[9]的研究结果一致。

表9 不同项目DPPH自由基清除能力结果

2.6 桔霉素检测结果

桔霉素是红曲发酵过程中产生的主要有害成分,检测其含量至关重要。由图1、图2中可知,红曲菌发酵辣木叶的产物经检测未发现桔霉素存在,发酵过程红曲菌性质稳定,安全性良好。

图1 桔霉素添加到发酵样品中的HPLC图

图2 发酵样品检测桔霉素的HPLC图

3 讨论

随着辣木产业在我国各个区域的大量发展,获取的辣木资源特别丰富,但是存在着如何深加工辣木资源和充分展现辣木的最大价值问题。Ajuogu等[32]研究了辣木叶对生殖活动的影响,Shi等[33]利用蛋白质组学研究分析了辣木叶提取成分,但是目前利用微生物发酵辣木叶开发颗粒剂产品较少。考虑到红曲菌的应用广泛,本研究将红曲菌和辣木叶有机结合,为红曲菌的发酵提供了新的对象,也为辣木资源的深度开发提供了一条新的途径。本研究通过单因素实验和正交试验,系统考察红曲菌发酵过程中各因素对MK产量的影响,得到红曲菌发酵辣木叶最佳的发酵条件,MK的产量为6.92 mg/g。通过单因素实验和正交试验,优选出最佳可溶性颗粒剂工艺配方,吸湿率为13.34%,休止角为31.62°,成型率为92.55%,综合评分达99.72分,工艺条件稳定可行。

试验还研究了所得发酵产品的抗氧化活性,结果表明红曲菌发酵辣木叶后的产品对DPPH自由基清除率达56.69%,均高于空白对照和未发酵产品,但低于阳性对照组维生素C的清除能力。说明了利用红曲菌发酵辣木叶获得的产品具有较强的抗氧化功能,其抗氧化活性与红曲菌发酵辣木叶之间的关系需进一步研究。红曲菌的发酵过程,可能产生的桔霉素极大地制约了红曲广泛利用,因此产品的发酵过程中要注意对桔霉素含量的监控,本研究未发现红曲菌发酵辣木叶的产物中含有桔霉素,说明发酵过程红曲菌性质稳定,安全性良好。

本研究将辣木叶和红曲菌的发酵产物制备成颗粒剂,为红曲和辣木资源的的市场化产品开发提供了研究基础,对促进红曲和辣木资源的市场化具有重要意义。但是颗粒剂只是诸多剂型中应用比较广泛的一种,下一步将继续研究性能稳定、用途多样的其他剂型,同时改进在红曲菌种的筛选、发酵条件优化、培养基的选择等方面的研究,以期达到规模化的生产。