阳和汤药组配伍对不同期Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效应及Th1/Th2 漂移的影响*

★ 叶峥嵘 吴琳（1.陕西中医药大学 陕西 咸阳 71046；.咸阳市中心医院 陕西 咸阳 71000）

温阳法在中医药治疗肿瘤方面具有着广泛的实践基础，而在其具体的处方和药物使用中存在着温阳散寒和温补肾阳单用及相互配伍的情况［1］。从生物医学角度深入分析它们的抑瘤效应和适用阶段及作用机制，对进一步发挥温阳法治疗肿瘤的作用具有重要的意义。做为治疗阴疽的经典效方，阳和汤治疗肿瘤具有着一定的理论依据与实践基础，而其组方中存在着温阳散寒药组和温补肾阳药组相互配伍使用的情况［2］。前期的研究结果表明，阳和汤温阳散寒药组和温补肾阳药组及两药组合用药组对同期荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用［3］。本研究探讨了阳和汤中的两组药物各自及相互配伍对不同时期Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效应及Th1/Th2 漂移的影响。

1 材料和方法

1.1 实验药物 阳和汤温补肾阳药组为熟地黄30 g，鹿角胶9 g；阳和汤温阳散寒药组为肉桂3 g，麻黄2 g，白芥子6 g，炮姜炭2 g；阳和汤两药组合用药为熟地黄30 g，鹿角胶9 g，肉桂3 g，麻黄2 g，白芥子6 g，炮姜炭2 g。上述三组药物均购买于西安中药饮片有限责任公司，经陕西中医药大学药学院中药鉴定学教研室鉴定，按所列计量精确称取，分别用500 mL水常规煎制并按人体用量的10 倍浓缩定容（其中含鹿角胶的打粉烊化），使其分别形成相当于生药0.65 g/mL、0.22 g/mL 和0.87 g/mL 的药液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 动物和瘤株 分隔5 天先后从西安交通大学医学院实验动物中心购买两批一月龄清洁级昆明种雄性小鼠50 只，体重18～20 g，许可证号SCXK（陕）2012-003，适应性喂养两天后造模。Lewis 肺癌瘤细胞株由第四军医大学实验动物研究中心提供，携带于C57BL/6 小鼠右腋皮下。

1.3 仪器和试剂 超净工作台（苏州净化设备有限公司）；蔡氏生物显微镜（德国）；RT-2100C 酶标分析仪（深圳市雷杜电子有限公司）；FA1104N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；SHH.W21 三用电子恒温水箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；LD4-2 低速离心机（北京医用离心机厂）；白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-4（IL-4）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（陕西博达生物科技有限公司）。眼科手术器械、细胞记数板、微量移液器和台盼蓝染液等均由陕西中医药大学中西医结合免疫研究室提供。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模 先后两次以相同的方法将负荷在C57BL/6 小鼠右腋皮下的Lewis 肺癌瘤块在无菌环境下剥离，不锈钢网过滤制成无菌单细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/mL，台盼蓝拒染实验显示活细胞比例大于95%。分别将上述前后两批50 只昆明种小鼠随机分为阳和汤温补肾阳药组（6.5 g/kg）、阳和汤温阳散寒药组（2.2 g/kg）、阳和汤两药组合用组（8.7 g/kg）、模型对照组和正常对照组，每组10 只。除正常对照组外，其余各组小鼠接种上述细胞悬液于小鼠右腋皮下（0.2 mL/只）。

1.4.2 用药方法 上述第二批小鼠造模5 天后形成荷瘤5 天的实验动物模型时，第一批小鼠已形成荷瘤10 天的实验动物模型，随即开始灌胃。正常对照组和模型对照组用生理盐水，阳和汤两药组合用组、阳和汤温肾补阳组和阳和汤温阳散寒组用上述制备药液连续灌胃10 天，0.2mL/次，1次/天。

1.5 指标检测

1.5.1 小鼠体重、脾指数、胸腺指数和抑瘤率 灌胃结束后量各组小鼠体重，处死小鼠剥离脾脏、胸腺和右腋皮下瘤块并称取重量，计算抑瘤率和脾指数与胸腺指数。抑瘤率（%）=（1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重）×100%，脾脏（胸腺）指数=脾脏（胸腺）重量（mg）/体重（g）。

1.5.2 小鼠血清IL-2 和IL-4 含量 灌胃结束后，在处死小鼠前，摘眼球取各组小鼠血液，离心获取血清，ELISA 法检测其中的IL-2 和IL-4 含量，并与正常对照组比较。具体方法为在96 孔包被板中设六孔标准孔，倍比稀释标准品稀释液，每孔加入100 μL，并设空白对照孔和零孔。样品孔每孔依次加入上述待测血清100 μL，37 ℃温育90 min 后洗涤各孔，每孔（除零孔）加入第一抗工作液50 μL，37 ℃温育60 min，再次洗板，每孔（除零孔）加入酶联工作液100 μL，37 ℃温育30 min，用洗涤液洗板后，每孔加入TMB 显色剂A、B 各一滴，37 ℃避光显色15 min，在每孔中加终止液一滴，轻轻混合，酶联检测仪450 nm 处测OD，根据标准曲线，分别检测各组小鼠血清IL-2 和IL-4 浓度。

1.6 数据统计 采用SPSS13.0 软件包（SPSS Inc.，Chicago，IL）处理数据，计量资料均数±标准差（）表示，两两比较采用q 检验，P<0.05 具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 对不同期Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效应 由于实验过程中灌胃操作技术的失误，荷瘤5 天的阳和汤温肾补阳组和阳和汤两药组合用组各有一只小鼠死亡。在荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠中，与模型对照组和阳和汤温补肾阳药组比较，阳和汤温阳散寒药组和阳和汤两药组合用组的移植瘤生长明显受到抑制（P<0.01）。在荷瘤10 天的Lewis肺癌荷瘤小鼠中，与模型对照组比较，阳和汤温补肾阳药组和阳和汤温阳散寒药组的移植瘤生长均受到抑制（P<0.05），阳和汤两药组合用组的移植瘤生长抑制更明显（P<0.01）；与阳和汤温阳散寒药组比较，阳和汤两药组合用组的移植瘤生长受到抑制（P<0.05）。结果见表1。

表1 对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效应（）

表1 对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效应（）

注：与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 对不同期Lewis 肺癌荷瘤小鼠体重、脾指数和胸腺指数的影响 在荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠中，与正常对照组比较，模型对照组荷瘤小鼠体重、脾指数和胸腺指数无异常。与模型对照组比较，阳和汤温补肾阳药组脾指数升高（P<0.05），阳和汤温阳散寒药组胸腺指数降低（P<0.05）。阳和汤温阳散寒药组脾指数和胸腺指数较阳和汤温补肾阳药组降低（P<0.05）；在荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠中，与正常对照组比较，模型对照组荷瘤小鼠体重和胸腺指数均明显降低（P<0.01），脾指数也降低（P<0.05）。阳和汤温补肾阳药组和阳和汤两药组合用组的荷瘤小鼠体重、脾指数和胸腺指数较模型对照组升高（P<0.05）。阳和汤温补肾阳药组荷瘤小鼠胸腺指数较阳和汤温阳散寒药组升高（P<0.05）。结果见表2。

表2 对Lewis肺癌荷瘤小鼠体重、脾指数和胸腺指数的影响（）

表2 对Lewis肺癌荷瘤小鼠体重、脾指数和胸腺指数的影响（）

注：与正常对照组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05

2.3 对荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠Th1/Th2 漂移的血清标志性细胞因子IL-2 和IL-4 的影响 与正常对照组比较，模型对照组荷瘤小鼠血清IL-2含量降低（P<0.01），IL-4 的含量升高（P<0.01）。与模型对照组比较，阳和汤温补肾阳药组和阳和汤温阳散寒药组荷瘤小鼠血清IL-2 的含量升高（P<0.05），阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-2 的含量明显升高（P<0.01），阳和汤温阳散寒药组和阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-4 的含量明显降低（P<0.01）；与阳和汤温补肾阳药组比较，阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-2 的含量升高（P<0.05），阳和汤温阳散寒药组和阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-4 的含量降低（P<0.05）。结果见表3。

表3 对荷瘤5天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影响（） ng/mL

表3 对荷瘤5天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影响（） ng/mL

注：与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 对荷瘤10 天Lewis 肺癌荷瘤小鼠Th1/Th2 漂移的血清标志性细胞因子IL-2 和IL-4 的影响 与正常对照组比较，模型对照组荷瘤小鼠血清IL-2 含量仍然明显降低（P<0.01），IL-4 的含量仍然明显升高（P<0.01）。与模型对照组比较，阳和汤温补肾阳药组和阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-2 的含量明显升高（P<0.01），阳和汤温补肾阳药组和阳和汤温阳散寒药组荷瘤小鼠血清IL-4 的含量降低（P<0.05），而阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-4 的含量降低更明显（P<0.01）；与阳和汤温阳散寒药组比较，阳和汤温补肾阳药组荷瘤小鼠血清IL-2 含量升高（P<0.05），阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-2 含量明显升高（P<0.01）；与阳和汤温补肾阳药组比较，阳和汤两药组合用组荷瘤小鼠血清IL-2 含量明显升高（P<0.01）。结果见表4。

表4 对荷瘤10天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影响（） ng/mL

表4 对荷瘤10天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影响（） ng/mL

注：与正常对照组比较，★★P＜0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

肿瘤归属于中医学“癥瘕”“积聚”“脏结”等病证的范畴［4］。《灵枢·五变篇》曰：“肠胃之间，寒温不次，邪气稍至，蓄积留止，寒多则气涩，气涩则生积聚也。”《伤寒论》130 条：“脏结无阳证，不往来寒热，其人反静，舌上胎滑者，不可攻也。”《素问玄机原病式》指出：“癥瘕颓疝，坚痞腹满……皆属于寒。”针对肿瘤这一有形之物，根据“积之始生，得寒乃生，厥乃成积”的理论，应选择温阳散寒使凝结消散；结合“阳化气，阴成形”和“人之一身阳气藏于肾中”的认识，应采用温补肾阳来治疗肿瘤。阳和汤出自《外科证治全生集》，方中熟地温补阴血、填精益髓，鹿角胶温补精血、补益肾阳。二者共用，正所谓“善补阳者，当以阴中求阳，则阳得阴助，而生化无穷”，发挥着温补肾阳的功效；肉桂和炮姜炭入血分而温经散寒、温通血脉，白芥子辛温通络散结，麻黄辛温宣散寒凝而开肌腠。四药合用，发挥着温阳散寒的作用。上述两组药物配伍使用，针对漫肿不红且坚硬如石的阴疽，标本兼治，虚实兼顾。生甘草则发挥着调和诸药的作用。《外科证治全生集》中的阴疽包括“乳岩”“恶核”“失荣”“石疽”等疾病，此类疾患相当于现代医学的肿瘤［5］。上述研究发现，阳和汤温阳散寒药组和阳和汤两药组合用对荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠具有明显的抑瘤效应；阳和汤温阳散寒药组和阳和汤温补肾阳药组对荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠有抑瘤效应，且阳和汤两药组合用小鼠对其的抑瘤效应更明显。此结果表明温阳散寒法和温补肾阳法单用和配伍使用在治疗肿瘤中存在着阶段的差异性。

肿瘤患者的病机是“整体为虚，瘤部为实”［6］。在寒积阳虚中，整体的虚是机体肾阳不足生化之源亏乏，致使寒邪内生，气化异常，血瘀痰凝逐渐形成；瘤部的实是局部寒凝津阻血瘀痰凝，表现为癥瘕、积聚和脏结等不断加剧的肿块及疼痛，日久则易耗气夺血，损伤阳气。肿瘤患者的全身衰弱，是局部肿瘤之邪所致，而全身衰弱又可促使局部肿瘤之邪亢盛，这种反复恶性循环，终致不治［7］。辨证论治是中医的基本特点，准确把握病性的虚实继而选用恰当的治则治法并处方用药以期达到“方证对应”，是获得临床疗效的关键。因此在温阳法治疗肿瘤的具体应用中，针对虚实病性扶正的温补肾阳和祛邪的温阳散寒应准确辨证，掌握适当的时机和分寸［8］。上述实验结果表明，阳和汤温阳散寒药组和具有温阳散寒药物的阳和汤两药组合用组对荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠具有明显的抑瘤效应，表明此阶段荷瘤机体可能存在着寒凝淤滞的邪实病机。而此时机体的正虚尚不明显，所以阳和汤温补肾阳药组对其无抑瘤效应；在荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠体内，明显增大的肿瘤组织不仅进一步体现着邪实的病机，而且出现肿瘤增殖耗损气血的正虚状态，阳和汤温阳散寒药组针对邪实发挥作用，阳和汤温补肾阳药组针对正虚产生效应，两药组均有较好的抑制肿瘤生长的作用。而阳和汤两药组合用组攻邪和扶正兼顾，所以在抑瘤方面的作用更为明显。

1986 年Mosmann 等［9］发现小鼠CD4+T 细胞按细胞因子产生的模式和生物功能具有Th1 细胞和Th2 细胞两种不同的亚群。人类同样存在着这两个T 细胞亚群［10］。其中Th1 细胞分泌IL-2 和IFN-γ等促进细胞免疫，Th2 细胞分泌IL-4 和IL-5 等参与体液免疫。正常情况下机体中Th1/Th2 细胞处于相对平衡的状态，分别分泌着各自的细胞因子彼此交叉调节、互相抑制［11］，形成一种动态的细胞因子网络。但在机体发生功能异常时，常表现出平衡偏向其中一方，此即为“Th1/Th2 平衡漂移”，进而引起许多疾病的产生和发展。近年来Th1/Th2 细胞亚群状态已成为肿瘤免疫治疗的研究热点［12］。Th1细胞诱导的免疫应答是抑制恶性肿瘤增生所必需的，肿瘤抗原特异性的Th1 细胞可自动回到肿瘤周围并分泌细胞因子，从而增强肿瘤微环境中的抗原提呈细胞的功能［13］。有研究表明，肿瘤患者处于Th2 细胞优势的分化状态，其产生的细胞因子对Th1 细胞增殖分化和细胞毒性T 淋巴细胞的功能具有抑制作用，从而导致机体抗肿瘤免疫功能减弱，使肿瘤细胞逃逸免疫监视和免疫攻击［14］。在肿瘤进程中，由Th1/Th2 平衡至Th2 占主导地位的转换是至关重要的因素，恢复Th1 和Th2 细胞之间的平衡状态在肿瘤的治疗中具有重要意义［15］。上述研究结果表明，荷瘤5 天和10 天的模型对照组小鼠血清IL-2 含量明显低于正常对照组，IL-4 含量明显高于正常对照组，均存在着Th1/Th2 平衡漂移向Th2 优势分化的情况，且荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠Th2 居于主导地位的情况更明显。针对荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠，阳和汤温阳散寒药组和阳和汤两药组合用不仅提高着Th1 细胞因子IL-2 的含量，更降低着Th2 细胞因子IL-4 含量，通过调节荷瘤机体内存在Th2 优势分化的Th1/Th2平衡漂移发挥着抑瘤作用。针对荷瘤10 天的Lewis肺癌荷瘤小鼠，阳和汤温阳散寒药组、阳和汤温补肾阳药组和阳和汤两药组合用均对移植瘤的生长发挥着抑制作用。它们的抑瘤作用机制可能与降低荷瘤小鼠血清细胞因子IL-4 含量有关，而温补肾阳药组和阳和汤两药组合用药的作用机制与提高荷瘤小鼠体重、脾指数和胸腺指数及血清Th1 细胞因子IL-2 含量关系密切，从而使荷瘤机体内Th1/Th2 平衡漂移向Th1 占主导的地位转换。