基于化学成分研究连翘-金银花药对不同煎煮方式

★ 魏惠珍 朱敏 金浩鑫 吕尚 吴柳瑾 饶毅*（.江西中医药大学 南昌 330004；.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330006）

连翘-金银花作为药对配伍最早出自于清代《温病条辨》的银翘散。二药配伍属于“七情”之一的相须，并走与上，轻清升浮宣散，清气凉血，清热解毒之力倍增，流通气血以消肿散结止痛，为临床常用药对［1-2］，在现代药理中具有抗炎［3］、抗菌、提高免疫力［4］、解热及抗自由基损伤［5］等作用。目前对该药对配伍的药理作用［6］、配伍比例、配伍前后挥发性成分的研究较多［7］，但对其化学成分的研究鲜有报道。封美慧等［8］研究了连翘-金银花药对醇提液的化学成分变化，林丽美等［9］对连翘-金银花药对粉末水提液的化学成分进行研究，邢学锋［10］对该药对水提液中化学成分及有效部位的变化进行了定量分析。现有的研究对连翘-金银花传统汤剂化学成分的研究不够全面，本文是在传统汤剂制备的基础上定量分析该药对合煎、单煎、单煎后合并4 种供试品溶液中指标成分的含量变化，定性分析了配伍前后化学成分的增减，更加全面、严谨的研究了连翘-金银花煎液中化学成分的变化，为该药对在临床及新药研发提供实验基础、新依据。

1 仪器与试药

SHIMADZU LC-20AD 高效液相色谱仪（LC-20AD 泵，SPD-M20A 检测器）；梅特勒AB-104N万分之一电子天平；SHIMADZU AUW220D 十万分之一电子分析天平；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）。

绿原酸对照品（批号110753，纯度为96.2%），连翘脂苷A 对照品（批号111810，纯度94.3%），连翘苷对照品（批号110821，纯度95.3%），三者均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A 对照品（批号2450-53-5，纯度大于98%）、异绿原酸B 对照品（批号14534-61-3，纯度大于98%），两者均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。10 批金银花饮片、10 批连翘饮片，购自山东、河南、山西等地；所有样品均由江西中医药大学刘勇教授鉴定为真品。

表1 样品信息

2 煎煮方式

2.1 金银花单煎 取饮片约20 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加12 倍水，浸泡30 min，一煎武火煮沸，文火煎煮15 min；二煎武火煮沸，文火煎煮15 min；合并两次滤液，即得金银花汤剂，并平行制备3 份。

2.2 连翘单煎 按上述“金银花单煎”方法制得连翘汤剂。

2.3 单煎后合并 将上述单煎得到的滤液，冷却后按体积比（1∶1）合并，即得单煎后滤液。

2.4 连翘-金银花合煎 分别取金银花饮片、连翘饮片各约20 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加12倍水，浸泡30 min，一煎武火煮沸，文火煎煮15 min；二煎武火煮沸，文火煎煮15 min；合并两次滤液，即得合煎汤剂。（注：单煎后合并、合煎饮片均为编号一一对应的饮片。）

3 含量测定

3.1 色谱条件 条件1（绿原酸）：色谱柱 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（12∶88）；检测波长：327 nm，流速：1.0mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

条件2（连翘酯苷A）：色谱柱 welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85），检测波长：330 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：10 μL。

3.2 对照品溶液的制备 精密称定绿原酸、连翘酯苷A 对照品适量，分别加50%乙醇、甲醇制成浓度分别为39.1 μg/mL 和94.16 μg/mL 的对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备 取“2”项煎煮液适量，分别用水稀释5 倍，供连翘脂苷A 含量测定；分别用水稀释25 倍，供绿原酸含量测定。

3.4 方法学验证

3.4.1 专属性试验 分别取绿原酸对照品、供试品和空白溶液，按上述条件进行测定，结果表明，空白溶液无干扰。

图2 含量测定HPLC图

3.4.2 精密度试验 连续进样对照品溶液6 次，结果绿原酸、连翘脂苷A 的RSD 值均在2.0%以内，表明仪器的精密度良好。

3.4.3 重复性试验 按“3.3”项下方法平行制备六份供试品溶液，进样测定，结果结果显示含量的RSD 值均小于2.0%，表明测定单煎、单煎后合并、合煎中绿原酸、连翘脂苷A 的方法重现性良好。

3.4.4 溶液稳定性试验 按“3.3”项下方法制备供试品溶液，制样后0、2、4、8、12、24 h 进样分析，结果显示供试品溶液中绿原酸、连翘脂苷A 的峰面积的RSD 值均小于3.0%，表明单煎、单煎后合并、合煎溶液在24 h 内基本稳定。

3.4.5 线性试验 分别取绿原酸、连翘脂苷A适量，配制浓度为6.7，13.4，26.7，53.5，133.7 μg/mL 绿原酸对照品溶液和浓度为0，18.8，37.7，94.18，188.3，941.6 μg/mL 连翘脂苷A 对照品溶液，测定峰面积，以浓度为（X）为横坐标，峰面积为（Y）为纵坐标，计算回归方程，结果显示绿原酸回归方程Y=3.13×107X-1.69×104（r=0.9999），表明绿原酸在6.7～133.7 μg/mL 范围内具有良好的线性关系；木犀草苷回归方程Y=1.5×107X-5.78×104（r=0.9999），表明连翘脂苷A 在0～941.6 μg/mL 范围内具有良好的线性关系。

3.4.6 加样回收试验 取已知含量单煎、单煎后合并、合煎的样品6 份，按100 %加入的量分别加入绿原酸对照品、连翘脂苷A 对照品适量，按“3.3”项下方法制备，计算回收率，结果显示金银花单煎中绿原酸平均回收率为99.45%（RSD=1.83%）；单煎后合并中绿原酸平均回收率为100.78%（RSD%=1.33%），合煎中绿原酸平均回收率为101.11%（RSD%=1.71%）；连翘单煎中连翘脂苷A 平均回收率为100.44 %（RSD=1.40%）；单煎后合并中连翘脂苷A 平均回收率为100.16%（RSD=1.56%），合煎中连翘脂苷A 平均回收率为99.47%（RSD%=1.64%）；说明测定单煎、单煎后合并、合煎中绿原酸、连翘脂苷A 方法的准确性良好。

3.5 含量测定结果 取上述“3.3”项下供试品溶液，按上述色谱条件分别测定合煎、单煎后合并、连翘单煎、金银花单煎中绿原酸、连翘酯苷A 的含量，结果见表2。使用统计学的非参数检验法中H 检验法分析可知［11-12］，H绿原酸=6.51，H连翘脂苷A=4.62；再由卡方分布的临界值表可知，H0.01=9.21，因H0.01，可认为不同的煎煮方式对绿原酸、连翘脂苷A 的含量差异基本无影响。

表2 不同煎煮方式绿原酸、连翘酯苷A含量测定结果（n=3）

4 指纹图谱

4.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，95%～88%B，20～50 min，88%～75%B，50～80 min，75%～50%B，80～90 min，50%～90%B）；检测波长：235 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

4.2 对照品溶液的制备 分别取绿原酸、连翘脂苷A、连翘苷、异绿原酸A、异绿原酸B 对照品适量，加50%乙醇溶解，即得混合对照品溶液。

4.3 供试品溶液的制备 同上述“2”项制备供试品溶液，直接进样。

4.4 方法学验证

4.4.1 稳定性试验 取供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h 后进样，分别计算其相对保留时间。结果显示相对保留时间的RSD 值均小于5%，表明该溶液在24 h 内稳定。

4.4.2 精密度试验 取供试品溶液，进样6 次，计算其相对保留时间。结果显示相对保留时间的RSD 值均小于5%，表明该仪器的精密度良好。

4.4.3 重复性试验 取同一批供试品溶液，平行制备6 份供试品溶液，进行测定，计算其相对保留时间，结果显示相对保留时间的RSD 值均小于5%，表明该方法的重现性良好。

4.5 合煎指纹图谱的建立 按“4.1”项下色谱条件测定10 批合煎的HPLC 图谱，将所得到的色谱数据导入《中药指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，采用多点校正将谱峰自动匹配，中位数计算得出样品指纹图的共有模式，结果见图3～4。

图3 合煎与单煎对照图谱

表3 合煎、合并指纹图谱相似度结果

由图3可知，连翘-金银花合煎有31个共有峰，其中峰14 为参照峰。由图4 中A、B 两者色谱图可知，两者色谱峰的个数基本一致，且两者色谱峰的相似度在0.95 以上，表明两者化学成分基本一致；再由图4 可知，合煎、单煎后合并中色谱峰均能归属到单煎的药材中，说明在该色谱条件下合煎和合并两者化学成分基本一致。

5 讨论

连翘-金银花为清热解毒常用的中药药对，论文以连翘中的指标成分连翘酯苷A、金银花中的指标成分绿原酸为考察指标，采用 RP-HPLC 方法测定金银花和连翘单煎、单煎后合并以及合煎样品的指标成分变化，经非参数检验法中H 检验法分析可知，合煎、单煎后合并、单煎三者之间的含量差异均无统计学意义，表明不同的煎煮方式对绿原酸、连翘脂苷A 的含量差异较小。

由连翘-金银花单煎、单煎后合并、合煎指纹图谱可知，合煎与单煎后合并中色谱峰个数一致，且两者色谱峰的相似度均在0.95 以上，而且合煎、单煎后合并中各色谱峰均能在药材单煎指纹图谱中找到，可认为单煎与合煎的整体的化学组成基本一致。

综上所述，不论从指标成分、还是从指纹图谱整体变化，均表明不同的煎煮方式对该药对的化学成分影响较小。该研究结果，可为临床上该药对的使用，提供一定的指导。