盐酒组合腌制对冷藏草鱼片质构和滋味品质的影响

胡丹，许艳顺，姜启兴，夏文水，余达威

(江南大学 食品学院, 江苏 无锡，214122)

预制调理水产品因其食用方便性,迎合大众快捷消费需求，导致消费增长快速。目前调制鱼制品主要采用冻藏贮运，但淡水鱼在冻藏条件下蛋白易冷冻变性、冻后品质下降严重，影响消费者的接受性。冷藏保鲜因其在非冻结条件下进行贮藏能够更好地保持鱼肉的新鲜品质，但由于微生物和内源酶的作用常引起鱼肉质构软化，保藏期短。如何延长鱼肉在冷藏条件下的保质期、提升冷鲜鱼肉品质是目前水产品保鲜研究领域的一个重要方面。目前国内外现有研究主要集中在采用生物涂膜或结合精油等天然产物、超高压处理等方法来抑制微生物生长，延长产品货架期，延缓鱼片的品质劣化[1-3]。目前对于低盐结合适度酒腌制对冷鲜鱼肉保鲜效果和贮藏过程中品质变化的影响还不清楚。

食品调味配料具有食用安全性高、成本低、应用方便等特点，更具生产应用价值。盐腌作为传统保藏手段在鱼类加工保藏中有广泛的应用。QIN等[4]采用低盐结合糖腌制对草鱼片进行保鲜处理，不仅可以延长产品货架期，还能提升鱼片的次黄嘌呤核糖核苷(inosine monophosphate，IMP)含量。白酒是中国传统发酵食品，主要成分为乙醇和水，同时含有一些酯类、高级醇和有机酸等，常用于肉品烹饪和加工中的调味处理。尽管体积分数75%的乙醇，作为消毒剂已广泛应用，但高度酒精处理会给鱼肉带来不同程度的不良风味，目前关于白酒腌制处理对肉品品质影响的研究还很少，现有研究也多是研究酒腌制处理对产品感官、风味和加工特性的影响方面[5-7]，对于酒腌制对冷鲜鱼肉保鲜效果和贮藏过程中品质变化的影响还不清楚。

前期研究发现，低盐结合适度白酒腌制能有效抑制冷藏鱼肉贮藏过程中腐败微生物的生长。质构和滋味是评价鱼肉品质的重要指标，但白酒组合腌制对鱼肉贮藏过程中质构、内源蛋白酶活性及滋味品质的影响尚不明确。因此，本研究以养殖大宗淡水鱼草鱼为对象，应用常用食品配料食盐和白酒，以剪切力、微观组织结构、组织蛋白酶活性、游离氨基酸及IMP含量为指标考察低盐结合白酒腌制对鱼肉冷藏保鲜效果的影响，以期为冷鲜调理鱼制品的开发与保鲜提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

草鱼：2018年10月上旬购于无锡欧尚超市，质量为(3.0±0.5) kg/条，体表均匀，鳞片完整有光泽；乙醇体积分数为65%的白酒(牛栏山)、食盐，无锡欧尚超市；纹路真空袋，美吉斯。

1.2 仪器与设备

YMX-958-10L型真空包装机，泉州亿闽信机电有限公司；TA-XT2i型物性测试仪，英国Stable Micro System公司；T18 高速分散机、F-7000 型荧光光谱仪，日本 HITACHI 公司；NIKON ECLIPSE CI型正置光学显微镜，日本尼康NIKON公司；Agilent 1100氨基酸分析仪,美国Agilent公司。

1.3 鱼片的腌制处理方法

鲜活草鱼剖杀，去头和内脏，沿背鳍线将鱼体剖成2片，用碎冰保证低温，用预冷自来水冲洗干净，沥干后，取背部白色肌肉，切成4 cm×3 cm×2.5 cm的块状。然后将鱼片随机分成3个实验组(1组为未经腌制的F组，另外2组为实验组分别标记为S和 SL组)。S组质量分数为2%食盐腌制9 h后取出洗净沥干后真空包装，SL组质量分数为2%食盐腌制3 h加入质量分数为5%的65%vol白酒共同腌制6 h后漂洗沥干后真空包装。腌制温度控制在4 ℃。每6 d取样进行感官评价、剪切力、微观结构、蛋白酶活性、游离氨基酸以及IMP含量分析。

食盐和白酒腌制条件的确定是经预实验以感官评定为指标对不同腌制浓度、时间进行选择，采用质量分数2%的食盐腌制3 h后添加质量分数为5%的65%vol白酒2段式腌制感官评分较高，鱼肉咸淡适中，无不良风味。

1.4 分析方法

1.4.1 感官评价

感官评价人员对鱼片色泽、气味和可接受性进行评价考察并给出喜好性打分。感官评价分为好、较好、一般、较差和差，对应的分值分别是5、4、3、2和1分，鱼肉感官评价平均分值≥ 4分为新鲜可接受产品，3～4分为中等可接受产品，<3分则视为腐败产品。

1.4.2 剪切力及微观结构的测定

剪切力和微观结构分别参照贾胜男等[8]、YANG等[9]的方法并加以改进，将鱼片按横切面切成2 mm×1 mm×1 mm的薄片，浸入预冷固定液中(无水乙醇、甲苯、冰乙酸的体积分数分别为60%、30%、10%)，4 ℃固定24 h。取出用体积分数为50%乙醇脱水1 h，然后用无水乙醇脱水1 h，之后依次放入等体积的乙醇-甲苯混合液中12 h无水甲苯中4 h，最后样品置于70 ℃蜡液中3 h，使用包埋机包埋后切成厚度为5 μm薄片，样品在展片机中展片，置于载玻片上，于70 ℃烘箱中融蜡1 h，之后依次浸没于甲苯、无水乙醇、体积分数为50%乙醇、去离子水中各20 min，最后于10 mg/mL曙红染色2 min，去离子水洗脱2～3 min。干燥后用显微镜观察微观结构。

1.4.3 蛋白酶活力的测定

1.4.3.1 粗酶液的提取

参照葛黎红等[10]的方法进行提取。

1.4.3.2 组织蛋白酶B、L及Ca激活蛋白酶含量的测定

参照HULTMANN等[11]的方法略加调整，分别采用Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC和N-Succinyl-Leu-Val-Tyr-AMC作为组织蛋白酶B、L及Ca激活蛋白酶的荧光底物，组织蛋白酶B、L狭缝宽度为10 nm，Ca激活蛋白酶的狭缝宽度为5 nm，空白使用100 μL去离子水代替100 μL荧光底物。

1.4.3.3 组织蛋白酶D的测定方法

参照HAGEN等[12]的方法略有修改，1.2 mL 0.2 mol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH 3.7)及0.4 mL 粗酶液37 ℃预热10 min，加入0.4 mL 30 mmol/L酸化牛血红蛋白在37 ℃下反应1 h，加入2 mL 100 mg/mL三氯乙酸溶液终止反应，反应终止后混合物于10 000×g下离心10 min，取上清液用lowry法[13]测定其中的肽含量。

1.4.4 游离氨基酸的测定

游离氨基酸的测定参照ZENG等[14]的方法略微修改，准确称取5 g样品，加15 mL 50 g/L的三氯乙酸，均质2 min后，用50 g/L的三氯乙酸定容至25 mL容量瓶中，常温超声30 min后静置2 h，取部分上清液用0.22 μm滤膜过滤后，滤液用氨基酸液相自动分析仪测定。

1.4.5 核苷酸降解产物的测定

根据SUN等[15]的方法略加修改，准确称取2 g 碎鱼肉，加入7.5 100 g/L的高氯酸溶液，均质并离心(10 000×g，10 min，4 ℃)，将沉淀物重复提取1次，合并上清液，pH调至6.5～6.8，定容至25 mL，用0.22 μm水系膜过滤后用于高效液相色谱分析。

1.4.6 数据处理方法

数据处理和分析使用软件Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0，计算平均值、标准偏差及进行显著性分析；数据绘图采用Origin 8.5。

2 结果与分析

2.1 感官品质变化

3组鱼片在冷藏期间感官评分变化如图1所示。贮藏1 d后，F、S和SL组感官值分别为4.7、4.7和5分，结果表明，低盐腌制在贮藏第1天，对鱼片的感官没有显著影响，但适度白酒处理后，鱼片的感官分值略有提升。随着贮藏时间延长，F组的感官评分下降最快，在贮藏第12天时已经处于感官腐败。S组鱼片虽然在初期与F组鱼片感官接近，但随着贮藏时间延长，S组直到第18天左右才出现不可接受的腐败气味，说明低盐处理鱼片可以在一定程度上抑制鱼片的腐败。SL组在整个贮藏期感官评分一致显著高于其余2组，真空冷藏第24天感官评分为3.1分，出现轻微不可接受的异味，冷藏30 d后，SL组鱼片感官上被认为完全腐败。

图1 鱼片在冷藏期间感官评分变化Fig.1 Changes in sensory scores of fillets during refrigerated storage

2.2 剪切力和微观结构变化

鱼肉含水量高，肉质相较畜禽肉更加细嫩柔软，剪切力能够较好反映冷鲜鱼肉新鲜度和质构的变化[16]，由图2可知，贮藏1 d SL组的剪切力明显高于S组和F组，这可能与干腌和高浓度的酒精使鱼肉适度脱水有关，但由于S组腌制盐含量较低，在剪切力上与对照组没有显著差异。由图3微观组织结构也可以明显看出，F组的肌纤维截面积大，S组及SL组肌纤维更为紧密，截面积减小，这与THORARINSDOTTIR等[17]研究结果一致。随着贮藏时间延长，3组样品的剪切力均呈现下降趋势，但SL组下降速度最慢，其次是S组，贮藏18 d后剪切力分别是对照组的1.8(SL组)和1.6倍(S组)，且SL组贮藏至30 d后剪切力仍为F组贮藏18 d后剪切力的1.6倍。结果表明，腌制处理能显著延缓鱼片的质构劣化，其中组合腌制的效果比单一盐腌的效果更佳。由图3也可明显看出，贮藏15 d后F组肌原纤维界限不清晰，组织结构松散。而SL组和S组纤维结构保持相对完整和紧密。30 d后F组由于鱼肉质构已完全软烂，无法进行微观结构观察，S组的肌原纤维结构已发生松散崩解，而SL组纤维结构还保持相对完整。结果表明，2段式组合腌制能够明显延缓鱼肉冷藏期间纤维崩解和质构劣化。

图2 鱼片在冷藏期间剪切力的变化Fig.2 Changes in shear force content of fillets during refrigeration

图3 鱼片冷藏期间微观结构的变化(100×)Fig.3 Changes in microstructure of fillets during refrigeration

2.3 组织蛋白酶B、L、D及Ca激活蛋白酶的变化

对腌制后的3组鱼片进行组织蛋白酶活性分析，结果如图4所示。

α-组织蛋白酶B;b-组织蛋白酶L;c-组织蛋白酶D;d-Ca激活蛋白酶图4 鱼片冷藏期间组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶D和Ca激活蛋白酶含量的变化Fig.4 Changes of contents of cathepsin B, cathepsin L, cathepsin D and calcium-activated protease of fish fillets during refrigeration

由图4可知，F组中的组织蛋白酶B和L在贮藏过程中随着时间延长呈现出先增加后降低的趋势，这与葛黎红[10]的研究结果一致。在贮藏12和24 d时，盐腌处理对组织蛋白酶B有显著的抑制效果(P<0.05)，而S组与SL组在整个贮藏期几乎没有显著性差异。3组鱼肉中的组织蛋白酶L在前6 d几乎没有显著性差异，贮藏6 d后，F组的鱼肉组织蛋白酶L的酶活力显著高于S组和SL组(P<0.05)，而S组的组织蛋白酶L的酶活力显著高于SL组(P<0.05)。结果表明,组合腌制处理相比纯盐腌制更能显著抑制鱼肉组织蛋白酶L的酶活力。有研究表明，草鱼片在冰藏条件下剪切力与组织蛋白酶B+L显著相关[18]。本研究中，组织蛋白酶L的活性在贮藏过程中一直显著高于组织蛋白酶B(图4)，虽然组织蛋白酶B和L均具有内肽水解活性，对肌原纤维蛋白及其他蛋白质具有广泛的降解作用，但组织蛋白酶L对蛋白质的水解贡献更大[19]，这也能部分解释S组在贮藏期剪切力低于SL组的原因(图2)。结果表明，组合腌制可以显著抑制由组织蛋白酶B+L引起的鱼片软化作用。贮藏过程中3组鱼片中组织蛋白酶D的酶活力变化如图4-c所示，组织蛋白酶D的酶活性在3组鱼片中随着贮藏时间延长均呈现先下降后上升的趋势，3组鱼片在整个贮藏期几乎没有显著性差异，说明盐腌和酒腌处理对鱼肉中组织蛋白酶D没有明显影响。Ca激活蛋白酶酶活力随着贮藏时间延长整体呈下降趋势，且F组的Ca激活蛋白酶酶活力在第1天时显著高于S组和SL组。有研究报道，Ca激活蛋白酶可能只在早期参与肌原纤维蛋白的拆卸[20]。贮藏初期SL组和S组的剪切力高于F组可能与抑制Ca激活蛋白酶活性有关。

鱼肉质构变化与鱼体内源蛋白酶活性紧密相关，组合腌制方式可以显著抑制组织蛋白酶L的活性及初期Ca激活蛋白酶的活性，从而减缓鱼肉冷藏期间的质构软化。

2.4 游离氨基酸含量的变化

由图5可知，冷藏期间鱼肉中总游离氨基酸含量呈现波动上升的趋势。贮藏第1天，3组鱼片的总游离氨基酸含量没有显著差异。随着贮藏时间延长，F组总游离氨基酸含量显著低于S组和SL组(P<0.05)。在贮藏第6天时，F组和S组总游离氨基酸含量与第1天相比显著下降(P<0.05)，游离氨基酸含量下降一方面可能与贮藏过程中鱼肉汁液流失有关，蛋白酶分解鱼肉的肌原纤维组织造成鱼片的持水力下降；另一方面微生物生长代谢也会利用游离氨基酸及在内源脱氨酶和脱羧酶的作用下生成生物胺等物质，导致氨基酸含量降低[21]。S组和SL组的总游离氨基酸含量显著高于F组，可能与抑制微生物生长和汁液流失有关。综上表明，组合腌制能减少鱼肉冷藏期间游离氨基酸损失。

图5 三组鱼片冷藏期间总游离氨基酸含量的变化Fig.5 Changes of total free amino acid content in three groups of fish fillets during refrigeration

游离氨基酸对品质的影响主要体现在滋味的贡献[23]。因此通过滋味活性值比较，可以更加客观地反映腌制处理对草鱼片冷藏过程中游离氨基酸所贡献滋味的影响。由图6可知，鲜味滋味活性值随着贮藏期延长呈现显著增加的趋势，而甜味滋味活性值和苦味滋味活性值在贮藏期各组差异并不明显。虽然鲜味氨基酸的滋味活性值较低，但谷氨酸与GMP、IMP等组合能产生鲜味协同作用[24]。由图6-a可知，贮藏第1天S组和SL组谷氨酸鲜味活性值分别是F组第1天的2.2和1.6倍，贮藏至18 d，谷氨酸鲜味活性值分别是F组的1.64和1.33倍，说明腌制处理可以显著提高鱼片的鲜味滋味。

a-鲜味; b-甜味图6 鱼片冷藏期间鲜味和甜味氨基酸滋味 活性值变化Fig.6 Changes in amino acid activity values of umami and sweet during fish fillet refrigeration

由图7可知，组氨酸在苦味滋味活性值中贡献最大，在贮藏期第1天，S组的组氨酸活性值显著低于F组，SL组与F组之间无显著性差异，随着贮藏时间延长，F组的组氨酸含量呈现先下降后上升的趋势，且变化范围大，SL组的组氨酸含量在前18 d一直高于F组和S组，组氨酸可通过细菌组氨酸脱羧酶转化成组胺[22]，因此，组氨酸的评价还应结合生物胺含量及微生物分析综合评价。F组组氨酸含量在第6天比第1天下降了约40.1%，相比S组分别和SL组仅下降了约26.8%及25.5%，且在贮藏后期SL组的组氨酸含量一直显著高于S组。这可能与抑制组胺代谢相关微生物生长有关。

图7 鱼片冷藏期间苦味氨基酸滋味活性值变化Fig.7 Changes of bitter amino acid flavor activity of fish fillets during refrigeration

2.5 IMP含量的变化

IMP是肉类产品中重要的呈鲜味物质，同时与谷氨酸会产生协同作用，增加肉品鲜味[25]。鱼片冷藏过程中IMP含量变化如图8所示，随着贮藏时间的延长，3组鱼片中IMP含量均呈现下降趋势。这与壳聚糖涂膜处理的草鱼片IMP含量变化规律相似[26]。IMP是鱼类的主要滋味贡献物质，通常在鱼类贮藏早期含量较高，在草鱼贮藏6 d内IMP含量出现下降[26]。本研究中F组草鱼在贮藏1 d后IMP含量为7.14 μmol/g，第6天IMP含量为4.90 μmol/g，较第1天下降了31.4%。S组和SL组较第1天IMP含量分别分别下降了15.8%和14.0%，说明腌制可有效延缓贮藏初期草鱼中IMP含量的降解。有研究表明，低盐结合低糖及醋和姜汁提取物腌制处理相比对照组均显著提高草鱼肉IMP的含量[4,27]，可能原因是腌制影响了IMP含量相关酶的活性[28]。F组、S组和SL组IMP含量在第12天时分别较第1天下降了71.1%、65.6%和57.8%，说明IMP的降解主要发生在鱼片贮藏的前12 d，且腌制处理延缓了IMP的降解，同时组合腌制的延缓效果要略优于单一的盐腌制。因此，2种腌制处理对减少鱼肉贮藏初期IMP降解有具有积极作用。

图8 鱼片冷藏期间IMP含量的变化Fig.8 Changes of IMP content of fish fillets during refrigeration

3 结论

通过比较不同腌制处理对草鱼片冷藏过程中感官、剪切力、微观结构、组织蛋白酶活性、游离氨基酸及IMP含量变化的影响研究，得出质量分数为2%的食盐结合质量分数为5%乙醇体积分数为65%的白酒组合腌制在具有较好感官接受性的基础上，可以通过抑制组织蛋白酶B、L在贮藏后期的活性和Ca激活蛋白酶在贮藏初期的活性有效延缓鱼片质构软化，较好维持肌纤维的组织结构的完整性，同时与对照组相比可以保留更多的滋味游离氨基酸和延缓IMP的降解，对提升冷藏鱼肉质构和风味具有积极的作用。