细菌脂肪氧合酶酶学性质分析及表达优化

庞翠萍，刘松，周景文，张国强*，李江华

1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡,214122) 2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡,214122)

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC. 1.13.11.12)属于脂质过氧化酶的异构家族，主要催化具有一个或多个cis,cis-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的特异性双加氧反应[1]，生成氢过氧化物，进一步转化为一系列具有生物活性的氧化脂类[2]。在食品加工领域，LOX可以介导小麦面筋中二硫键的形成，起到强筋、改善面团流变性的作用[3]。LOX也可与过氧化氢酶、异构酶和脱氢酶协同作用，增强水果和蔬菜的自然香气[4]。基于LOX开发的漂白剂和洗涤剂具有天然、温和、多效等特点[5]。此外，在制药行业中，LOX则可用于氯丙嗪的去除[6]。

现阶段，商业化的LOX主要来源于植物提取，但由于原料批次间成分不稳定及提取方法低效等问题，LOX导致成品质量不稳定，成本较高。随着生物技术的发展，微生物发酵生产LOX因其生产成本低，绿色高效而得到广泛的关注。常用的模式菌株Escherichiacoli具有遗传背景清晰、生长周期短、培养成本低、产量高等优点，常被用作重组蛋白的表达宿主[7]。细菌来源的LOX在E.coli表达系统中具有高效表达的潜力。其中，Pseudomonasaeruginosa来源的LOX被研究的较多[8]，Burkholderiathailandensis来源的LOX因其能有效转化亚油酸为羟基不饱和脂肪酸等，用于化妆品防腐剂也被关注[5, 9]。目前，重组LOX存在表达量低、稳定性差等问题，限制了其工业化生产与应用。随着现代酶工程技术的发展，通过对不同来源LOX酶学性质的分析比较，利用分子改造与表达优化等策略将有利于实现LOX的高效异源表达。本研究通过构建重组E.coli分别表达P.aeruginosa与B.thailandensis来源的LOX并对其酶学性质比较分析，选择酶学性能优良的PaLOX进一步表达优化，提高其可溶性表达水平，为构建高效的LOX表达系统奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

本研究所用质粒与菌株见表1。

1.1.2 试剂

DNA聚合酶、DNA连接酶、E.coli感受态,TaKaRa公司；ClonExpress®Ⅱ One step Cloning Kit试剂盒,南京诺唯赞公司;质粒提取试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)等,生工生物工程(上海)股份有限公司；亚油酸,麦克林(上海)公司。所有化学试剂均为国产分析纯。

表1 研究所用质粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this work

1.1.3 培养基和缓冲液

LB(Luria-Bertani)培养基(g/L)：酵母粉5、胰蛋白胨10、NaCl 10、自然pH。

TB(Terrific-broth)培养基(g/L)：酵母粉24、胰蛋白胨12、甘油5、KH2PO42.31、K2HPO4·3H2O 16.43、pH 7.0。

固体培养基在此基础上添加质量分数为1.5%～2%的琼脂粉。

缓冲液A：20 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.5。

缓冲液B：20 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，500 mmol/L咪唑，pH 7.5。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒构建

基于E.coli密码子偏好性优化合成Btlox基因(序列号：YP_442874.1)。为便于纯化，设计引物F1、R1(见表2)在N端引入组氨酸标签，PCR扩增得到Btlox片段。质粒pET-22b(+)经BamH I和Hind III双酶切后得到载体pET-22b(+)的线性化片段。经重组、转化即得到表达载体pET-22b(+)/Btlox。

表2 质粒构建过程中所用引物Table 2 Primers used in the construction of plasmids

质粒pCold-TF经BamH I和Hind III双酶切后得到载体pCold-TF的线性化片段。利用引物F2、R2(见表2)扩增得到目的基因Palox片段,经重组、转化得到表达载体pCold-TF/Palox。引物、基因合成与DNA测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2 重组LOX的表达

将各株重组甘油菌划线于LB固体培养基中，37 ℃条件下培养12 h，单菌落接种于装有10% LB培养基的250 mL 摇瓶中，37 ℃，220 r/min条件下培养8～10 h。按4%的接种量接入装有10% TB培养基的250 mL摇瓶中，于37 ℃，220 r/min条件下培养至菌体密度(OD600)达到0.5～0.6，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，20 ℃诱导培养24 h。以上培养过程均需添加100 μg/mL氨苄青霉素以维持质粒稳定及防止杂菌污染。

1.2.3 重组LOX的纯化

利用镍柱亲和层析的方法对LOX蛋白进行分离纯化。具体过程如下：不同重组菌的发酵液及细胞提取物均在4 ℃,14 000 r/min下离心15 min取上清液，并用0.22 μm的混合纤维素膜过滤除杂。将样品上样于已用缓冲液A预平衡的镍亲和层析柱中，待再次平衡后，用8%缓冲液B洗脱杂蛋白。用20%缓冲液B洗脱目标LOX，随后于预冷的缓冲液A中在4 ℃环境下透析获得纯蛋白。

1.2.4 菌体浓度OD600值的测定

发酵液用缓冲液A稀释相应倍数后，检测600 nm下的吸光值，以OD600值表示。OD600值与菌体干重之间的换算关系为当OD600值为1时，菌体质量浓度为0.578 g/L，可以计算出相应OD600值所对应的菌体干重。

1.2.5 LOX酶活力的测定

LOX的酶活力检测方法根据STEFAN[10]的方法进行了改进。酶活力测定条件：亚油酸在缓冲液A中稀释至终浓度0.32 mmol/L，将200 μL亚油酸底物缓冲液与20 μL稀释的LOX酶液混匀，25 ℃孵育4 min。每隔10 s向混合物中添加10 μL 10 mg/mL可溶性淀粉和40 μL饱和碘化钾溶液。最后，添加500 μL 体积分数15.0%的乙酸溶液显色10 min，测定470 nm下的吸光值。在所有的实验中，以失活LOX作为空白对照。单位LOX酶活力定义：1 min内470 nm下的吸光值增加0.001即为1个酶活力单位(U)。

1.2.6 SDS-PAGE电泳及蛋白浓度检测

10%的NuPAGE®SDS-PAGE蛋白胶用于分析蛋白的表达水平，以2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液为电泳缓冲液，上样量为15 μL，电泳电压为120 V。采用Brandford方法[11]测定蛋白浓度。

1.2.7 LOX最适反应温度和热稳定性的测定

最适反应温度：将溶有底物的缓冲液A分别在20～60 ℃的条件下孵育10 min，在不同温度下测定LOX酶活力，以酶活力最高者为100%。

热稳定性：重组LOX的热稳定性用30 ℃和50 ℃下酶活力的半衰期(t1/2, min)来表示。将纯酶用缓冲液A稀释到100 μg/mL，在不同温度下保温，间隔5 min取样测定残余酶活力，将残余酶活力按照文献所述方式拟合并计算半衰期(t1/2, min)[12]。

1.2.8 LOX最适反应pH和pH稳定性的测定

最适反应pH：分别用浓度为20 mmol/L的CH3COOH-CH3COONa (pH 3～6)、K2HPO4-KH2PO4(pH 6～8)、C2H5NO2-NaOH (pH 8～11)的缓冲液配制底物，测定纯酶在不同pH下的酶活力，将最高酶活力值定义为100%，采用非线性回归拟合曲线。

pH稳定性：将纯酶液用上述不同pH缓冲液稀释至100 μg/mL，在25 ℃下放置1 h，测定残余酶活力，以未保温酶液的酶活力为100%，采用非线性回归拟合曲线。

1.2.9 金属离子对酶活力的影响

将纯酶在pH 7.5,20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中透析以置换缓冲液A。在底物中分别添加终浓度为0.1 mol/L和1 mol/L的一价(Li+、Na+)、二价金属离子(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)，测定添加金属离子后纯化酶的酶活力，以无任何添加物下的酶活力为100%。

1.2.10 底物促溶剂对酶活力的影响

在缓冲液A中分别添加体积分数为2%和6%的有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、二甲基亚砜)促进底物在缓冲液内分散，测定添加底物促溶剂后纯酶的酶活力，以无任何添加条件下的酶活力为100%。

1.2.11 LOX的动力学常数测定

用缓冲液A配制不同浓度(0.02～0.2 mmol/L)的亚油酸底物溶液，在25 ℃下分别测定LOX催化不同浓度亚油酸生成氢过氧化物的速率，采用非线性回归拟合计算Km和Kcat。

2 结果与分析

2.1 LOX基因进化树构建与性质分析

通过MEGA 6.06软件对12种来源的LOX基因序列进行分析，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，通过Kimura 2-Parameter Distance模型计算进化距离。如图1所示，来源于P.aeruginosaPA01和B.thailandensisE264的LOX进化距离接近。结合前期研究报道(见表3)，来源于P.aeruginosa、B.thailandensis的LOX的底物亲和力相对其他原核细菌来源的高，具有较大的开发潜力。因此，我们选取来源于P.aeruginosa和B.thailandensis的LOX基因进行异源表达，并比较分析其酶学性质。

2.2 LOX在E. coli BL21(DE3)中的表达

为研究LOX的表达情况，分别在E.coliBL21(DE3)中构建表达PaLOX、BtLOX的重组质粒pET-22b(+)/Palox、pET-22b(+)/Btlox(图2-a)，并在20 ℃条件下诱导表达。

图1 LOX的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree on the basis of LOXs

表3 LOX酶学性质分析Table 3 Comparison of LOXs properties from different sources

a-LOX表达式质粒；b-SDS-PAGE电泳分析图 M-蛋白质标准分子量；箭头表示PaLOX和BtLOX蛋白条带图2 构建的LOX表达质粒和Palox、Btlox 表达蛋白SDS-PAGE电泳分析图Fig.2 Construction of LOX expression plasmid and SDS-PAGE analysis of the expressed Palox and Btlox

通过蛋白表达分析发现，PaLOX、BtLOX在胞内可溶和不溶部分均有明显条带，其大小约为70 kDa。而BtLOX胞外未见重组蛋白条带(图2-b)。LOX活性结果显示，PaLOX发酵上清液LOX酶活力为351 U/DCW(Units per Dry Cell Weight)，胞内为726 U/DCW；BtLOX胞内酶活力为597 U/DCW。上述结果表明，Palox和Btlox基因在E.coli中均实现了可溶表达，与以往研究报道[13]不一致的是，BtLOX表达过程中产生了大量的包涵体，可能是由于诱导温度高于16 ℃所致。

2.3 最适反应温度和热稳定性

为评估LOX的应用潜力，对LOX的最适反应温度和热稳定性进行了比较分析。结果表明，重组PaLOX和BtLOX的最适反应温度分别为25和35 ℃(图3-a)。随着反应温度的不断升高，当反应温度超过50 ℃时，2种来源的LOX活力均显著降低，但BtLOX活性下降较PaLOX明显。进一步研究LOXs的热稳定性发现，在30 ℃的条件下孵育，PaLOX和BtLOX的酶活力下降趋势缓慢，t1/2分别为59 min和157 min。在50 ℃的条件下孵育，随着时间的延长，二者活力下降趋势均较明显，PaLOX和BtLOX的t1/2分别为7 min和5 min(图3-b)。上述结果表明，30 ℃条件下重组BtLOX的稳定性较PaLOX好，而在50 ℃条件下则较PaLOX差。

a-最适反应温度；b-不同温度下的热稳定性图3 温度对LOX催化活性及稳定性的影响Fig.3 Effects of temperature on the catalytic efficiency and stability of LOX

2.4 最适反应pH和pH稳定性

为了评估pH对LOX的影响，测定了pH在3.0～11.0之间LOX的酶活力变化。结果显示，重组PaLOX和BtLOX的最适反应pH分别为7.0和7.5，pH值>8.0或<6.5均会使LOX的催化活性快速下降；当pH<4.5或>10.0时，LOX的催化活性基本完全丧失(图4-a)。对LOX的pH稳定性进行分析，结果表明重组PaLOX在pH 6.0～10.0之间均较BtLOX稳定，而在pH<5.0时，BtLOX的稳定性有所提高(图4-b)。

a-不同pH条件下LOX的催化活性； b-不同pH条件下LOX的稳定性图4 pH对LOX酶活力及稳定性的影响Fig.4 Effects of pH on the catalytic efficiency and stability of LOX

2.5 金属离子对LOX酶活力的影响

对酶有激活作用的激活剂，能在酶与底物之间形成一种酶-金属离子-底物的三元复合物，有利于底物与酶的活性中心结合；而对酶活力有抑制作用的，则可作为酶的抑制剂。因此，实验研究了金属离子对2种LOX酶活力的影响(图5)。其中Mg2+和Na+对PaLOX和BtLOX有激活作用，Cu2+、Zn2+对二者有明显的抑制作用。值得注意的是，低浓度的Fe2+对BtLOX有激活作用，而对PaLOX则有抑制作用。

a-金属离子对BtLOX活性的影响； b-金属离子对PaLOX活性的影响图5 金属离子对LOX催化活性的影响Fig.5 Effect of metal ions on catalytic activity of LOX

2.6 底物促溶剂对LOX酶活力的影响

酶和底物之间的结合能力是酶催化反应的主要推动力，其中底物的溶解度是直接影响酶和底物结合的因素。通过比较不同底物促溶剂对LOX酶活力的影响，发现体积分数为2%的甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇和丙酮对PaLOX的酶活力影响不大。在体积分数为6%下，PaLOX酶活力受到了抑制，可能是高浓度的有机溶剂使部分酶失活所致。体积分数为2%和6%的甲醇、乙醇、乙二醇对BtLOX酶活力均有不同程度的提高，特别是甲醇和乙二醇能显著提高40%的酶活力，可能是由于甲醇和乙二醇改善了底物亚油酸的溶解度，进而提高了BtLOX的酶活力(图6)。AN等[14]曾报道体积分数为6%的甲醇可以作为底物促溶剂有效改善LOX的催化效率。

2.7 LOX酶动力学分析

酶的动力学参数是评价酶与底物的亲和力及催化活性的重要指标。据报道，野生型PaLOX以亚油酸为底物的Km值为660 μmol/L[19]，而进行重组表达后，Km值则为48.9 μmol/L[8]，表明重组表达有利于提高PaLOX对底物的亲和力。因此，分析比较了重组PaLOX和BtLOX在不同亚油酸浓度下的酶促动力学参数(表4)。结果表明，以亚油酸作为底物时，重组表达的PaLOX的底物亲和力较BtLOX高14.9倍；Kcat/Km较BtLOX高16.7倍。因此，PaLOX在底物亲和力、催化效率以及表达效果上优势明显，具有更好的开发应用潜力。

表4 LOX酶动力学参数Table 4 LOX kinetic parameters

2.8 诱导剂优化对PaLOX表达水平的影响

如何提升外源蛋白高效、可溶表达是工业酶生产与应用的瓶颈。前期研究也发现，虽然2种细菌来源的LOX均能异源表达，但表达过程中存在着大量的包涵体，可溶表达水平较低。为进一步实现LOX的高效可溶表达，选择可溶性表达与应用潜力较好的PaLOX，通过设计不同浓度的IPTG和乳糖的组合添加，进行表达条件优化。结果表明，随IPTG浓度的降低，乳糖浓度的增加，PaLOX的酶活力在不断增加。当单独使用乳糖作为诱导剂时，PaLOX酶活力较IPTG作为诱导剂时提高了1.53倍，可溶表达水平提高了2.41倍，不可溶部分也提高了1.29倍(图7)。虽然更换诱导剂可以大幅提高PaLOX的表达水平与酶活力，但未能完全解决包涵体问题。

1-1 mmol/L IPTG;2-0.8 mmol/L IPTG+0.56 mmol/L乳糖; 3-0.6 mmol/L IPTG+1.11 mmol/L乳糖;4-0.4 mmol/L IPTG+ 1.67 mmol/L乳糖;5-0.2 mmol/L IPTG+2.22 mmol/L 乳糖;6-2.78 mmol/L乳糖图7 不同浓度IPTG和乳糖浓度组合对LOX活性 和表达水平的影响Fig.7 Effect of combination of IPTG and lactose concentration on LOX activity and expression level

2.9 分子伴侣促进PaLOX的可溶表达

在重组蛋白的表达过程中，合适的载体和分子伴侣对重组蛋白的正确折叠，防止包涵体的形成具有积极作用[20]。触发因子(triggering factor，TF)是一种来源于E.coli的核糖体结合伴侣蛋白，是第1个与新生多肽链相互作用并协助蛋白质共翻译折叠的伴侣[21]，可有效促进蛋白的可溶表达。因此，构建了分子伴侣TF融合表达质粒pCold-TF/Palox(图8-a)，分析TF对PaLOX可溶表达的影响。结果表明，TF-PaLOX融合酶活力较PaLOX提高了1.85倍，达到4520 U/DCW(图8-b)。SDS-PAGE分析显示，胞内不溶部分基本消失，可溶表达水平提高了3.19倍(图8-c)。与其他来源的标签相比，TF表达效率高，可溶性效果好，能有效促进PaLOX的可溶表达，具有重要的应用价值。

a-pCold-TF/lox表达质粒示意图；b-胞内LOX活性分析；c-SDS-PAGE电泳分析 M-蛋白质标准相对分子质量；1,2-TF-PaLOX的SDS-PAGE分析；3,4-PaLOX的SDS-PAGE分析；其中1,3-胞内可溶部分；2,4-胞内不溶部分图8 TF对LOX表达的影响Fig.8 Effect of TF on LOX expression

3 结论与讨论

由于LOX在食品、医药、造纸等领域有着广泛的应用，研究者对其进行了大量研究，包括从天然酶的分离提取[22-23]到LOX异源表达与分子改造等[17, 24]。到目前为止，已经有大量来自植物[25]、动物[26-27]和真菌[16, 24]等的LOX基因被克隆并成功表达。本研究以原核细菌来源的P.aeruginosa、B.thailandensisLOX基因为研究对象，通过将其在E.coli中异源表达，比较酶学性质，并利用优化诱导剂及分子伴侣融合表达策略，最终实现了LOX在E.coli表达系统中的高效可溶性表达。实验结果表明,TF作为促折叠的分子伴侣，通过与未折叠的蛋白结合，有效促进LOX的可溶表达。另外，TF催化肽基脯氨酰键的顺反异构化，可能也有利于改善蛋白质折叠过程中的限速步骤[21]。

目前研究表明，细菌来源的LOX的最适反应温度和热稳定性较其他来源的LOX差，限制了其工业应用。已有对LOX热稳定性研究的报道，例如通过在LOX的N-端和C-端的loop结构域(L6)插入1～3个L6序列[28]，或融合双亲短肽[8]，以及高柔性loop区域改造[29]等策略，可有效提高其热稳定性。因此，在后期研究中，进一步利用理性改造、定向进化等策略进行LOX分子改良，并结合高效的蛋白表达系统，将有利于实现LOX的高效生物合成，有效拓展LOX的工业应用范围。