IRAK-M基因SNP位点rs1821777多态性与成人支气管哮喘的相关性*

何志伟， 钱效森， 罗岚， 刘毅

(民航总医院 呼吸内科， 北京 100123)

白细胞介素1受体相关激酶-M (interleukin-1 receptor-associated kinase-M，IRAK-M)是白细胞介素-1受体相关激酶家族的主要成员之一，是Toll样受体(toll-like receptor)信号通路的重要负性调节因子，负责调节先天免疫稳态[1-2]。IRAK-M在肺部主要由树突状细胞、巨噬细胞及气道上皮细胞等表达[3]。越来越多的证据表明IRAK-M在哮喘或特应性皮炎、系统性红斑狼疮及炎症性肠病等多种疾病不同发展阶段对免疫反应具有不同调节作用[4-8]。人IRAK-M基因由12个外显子组成，位于12号染色体上(12q14.1-12q15)[9]，由长约65 kb的核苷酸区域构成[10]。IRAK-M已有多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点被发现，是目前国际研究哮喘易感性及疾病调节基因的重要候选基因之一[11]。目前国内尚缺乏IRAK-M基因位点rs1821777多态性与哮喘易感性及哮喘表型相关性的研究，因此本研究对成人哮喘患者IRAK-M基因位点rs1821777多态性进行分析，旨在获得中国人群相关位点的资料，研究该位点与哮喘易感性的关系以及对疾病表型调节的重要性。

1 资料与方法

1.1 对象、主要试剂与仪器

1.1.1对象 选取2014—2019年就诊呼吸内科门诊的18～60岁成人哮喘患者541人作为哮喘组，要求符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘诊断标准(2016年版)[12]，首次就诊的哮喘患者，完成全面的病史评价、完成符合质量控制要求的肺功能检查(如肺通气功能、肺弥散功能、气道可逆性或乙酰甲胆碱激发试验等)；排除患有冠状动脉粥样硬化性心脏病、风湿免疫性疾病、高血压病、严重糖尿病、恶性肿瘤及患有其他呼吸道急慢性疾病等。选取同期体检中心的健康体检者514人作为对照组，要求与患者无亲缘关系的汉族健康成年人、无呼吸系统急慢性疾病，完成全面的健康体检评价、完成符合质量控制要求的肺功能检查；排除过敏、哮喘、或慢性呼吸道疾病等病史，外周血嗜酸粒细胞水平不在正常范围内，伴其他严重心肺疾病或脑血管疾病。

1.1.2主要试剂和仪器 全血基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，SNaPshot试剂盒ABI PRISM® SNaPshotTMMultiplex Kit(美国ABI公司)，Taq酶TaqHotStart DNA Polymerase(日本Takara公司)；WD-9413B凝胶成像仪(北京六一仪器有限公司)，3730XL测序仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1临床资料收集 收集2组研究对象的性别、年龄、血常规检查结果、血清免疫球蛋白E(serum immunoglobulin E，sIgE)水平及肺功能测定结果[包括1 s用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)、FEV1实测值与预测值比值、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、FEV1/FVC]。

1.2.2基因检测 抽取2组研究对象空腹外周静脉血3 mL，置于EDTA抗凝管，提取全血基因组DNA，应用SNaPshot法对IRAK-M基因rs1821777位点进行基因分型，使用Primer5软件设计引物并进行合成。IRAK-M基因rs1821777位点扩增引物F为5′-AGACAGTTGATTGACTGCAGC-3′、引物长度21 bp，R为5′-TCATCTCTACATGCTCAGCAC-3′、引物长度22 bp；IRAK-M基因rs1821777 位点延伸引物为YS ttttttttttAGAGATAGGTCCACACACAAA，引物长度31 bp。PCR反应10 μL体系包括2.5×Buffer 4 μL、扩增引物工作液0.2 μL、Taq(5 U/μL)0.1 μL、dNTP 0.8 μL及DNA 50 ng，加双蒸水至10 μL；PCR反应条件为95 ℃预变性5 min、95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，上述3个步骤循环35次，72 ℃延伸10 min；PCR产物纯化为PCR产物15 μL加入碱性磷酸酶 5 U和核酸外切酶I 2 U，37 ℃消化60 min，75 ℃灭火20 min，4 ℃保存备用；延伸反应10 μL体系包括纯化的PCR产物1 μL、延伸引物0.2 μmol/L及SNaPshot Reaction Mix 5 μL，加双蒸水至10 μL；PCR反应条件为96 ℃预变性30 s、96 ℃变性10 s、50 ℃退火5 s、60 ℃延伸30 s，上述3个步骤循环30次，4 ℃延伸60 s；延伸反应产物10 μL，加入碱性磷酸酶0.5 U，37 ℃消化1 h，75 ℃灭火15 min；将所得产物置于ABI 3730XL遗传分析仪进行检测，采用Gene Mapper 3.2软件进行基因分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 临床资料

哮喘组患者外周血嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞比例及血清IgE(经过对数转换后)水平均高于对照组，FEV1实测值与预测值比值、FEV1/FVC则均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；2组研究对象年龄及性别分布的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组研究对象临床资料Tab.1 Comparison of the general information

2.2 基因型和等位基因频率分布

2组研究对象基因型分布和等位基因频率的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组研究对象IRAK-M基因rs1821777位点的多态性[n(%)]Tab.2 Polymorphism of IRAK-M gene rs1821777 locus between two groups[n(%)]

2.3 成人哮喘患者rs1821777位点基因型与哮喘临床表型的关系

将哮喘患者中rs1821777位点基因型为CC的患者(CC组)与哮喘患者中rs1821777位点基因型为TT或CT的患者(TT+CT组)进行比较，TT+CT组哮喘患者FEV1实测值与预计值比值、FEV1/FVC较CC组降低，但外周血嗜酸性粒细胞比例和免疫球蛋白水平(经过对数转换后)升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 rs1821777位点基因多态性对成人哮喘患者临床特征的影响Tab.3 Effect of the polymorphism of IRAK-M gene rs1821777 locus on adult asthma

3 讨论

人类白细胞介素1受体相关激酶处于模式识别受体Toll样受体/白介素-1受体信号途径的中间环节，在调节机体的自身免疫中起重要的枢纽作用，参与呼吸机肺损伤、酒精性肝损伤、糖尿病、心肌梗塞、结核、脑卒中、结肠癌及葡萄膜炎等疾病的发病[13-20]。许多研究发现IRAK-M基因与哮喘发病相关，但IRAK-M与哮喘的关系在不同人群中所得到的研究结果尚不统一[21-24]。意大利研究发现，包括rs1821777在内的4个SNP在哮喘组与对照组患者中存在差别，且IRAK-M与发病年龄小于13岁的哮喘患者易感性相关[21]；美国非波多黎各白种人儿童患者中，采用全基因组关联分析研究(genome-wide association study，GWAS)也发现，包括rs1821777在内的2个SNP与哮喘相关[22]；墨西哥的GWAS儿童哮喘患者研究结果不同，未发现IRAK-M与哮喘相关[23]；亚洲人群中，日本的研究亦未发现IRAK-M与哮喘相关[24]。国内尚缺乏IRAK-M与汉族人群哮喘关系的研究。本研究发现rs1821777位点基因多态性在哮喘组与对照组分布差异无统计学意义(P>0.05)，但是TT+CT组哮喘患者血清外周血嗜酸性粒细胞比例及外周血免疫球蛋白水平较CC组哮喘患者升高(P<0.05)，且肺通气功能比rs1821777 C组哮喘患者更差(P<0.05)，提示IRAK-M基因 rs1821777 位点多态性参与成人哮喘患者临床表型调节，但与成人哮喘易感性无关。

IRAK-M参与哮喘发病及病理生理进展的具体机制研究较少。有研究表明，在卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏的大鼠肺中IRAK-M表达明显增加，IRAK-M基因敲除的大鼠气道炎症细胞浸润、气道反应较野生型大鼠更明显、炎症因子更多、幼稚CD4+T细胞更多向Th17分化[25]；进一步研究提示，IL-33-PIN1-IRAK-M轴可能是IRAK-M在过敏性哮喘中的具体作用机制之一[26]。过敏性哮喘是Th2细胞介导的免疫疾病，在吸入过敏原的刺激下，气道上皮细胞首先产生IL-33，通过TLR/IL-1R信号传导，导致T辅助细胞分泌IL-13等细胞因子，在细胞因子的刺激下，脯氨酰顺反异构酶PIN-1(调节因子)被激活，与异构化的IRAK-M的突变区S110A结合后，导致树突状细胞IRAK-M核转位及诱导炎症基因产生[26]。激活的树突状细胞可以诱导T细胞向TH2细胞分化，延长嗜酸性粒细胞的存活、粘附、脱颗粒，从而引发一系列免疫反应[26]。在人体试验中，通过测定重组尘螨P1 (recombinant dermatophagoides P1 protein，Der-p1) 蛋白处理前后哮喘患者的肺泡灌洗液、活检标本及细胞刷片免疫染色，发现处理后的IRAK-M蛋白表达增加，表达IRAK-M的炎症细胞增加，PIN1的催化活性增加，IRAK-M下游目标炎症基因表达增加[26]。这与上述动物实验一致。有学者研究发现IL-33可能通过作用于人肺成纤维细胞而导致哮喘的气道重塑，从而导致哮喘患者FEV1下降[27]。因此有理由推测IRAK-M基因rs1821777位点多态性可能通过影响IRAK-M蛋白的表达，进而影响气道重塑和肺功能，但其具体机制需要进一步研究。

综上所述，本研究表明IRAK-M基因rs1821777位点多态性与哮喘患者肺功能恶化及嗜酸性粒细胞持续高表达有关，但还需扩大样本进一步证实上述结果，并从基因功能方面进一步阐述IRAK-M基因与哮喘的相关性。