泻肺利水合剂对慢性心衰大鼠心肌氧化应激和线粒体自噬的影响*

李超， 王巍， 杨雪卿

(北京中医医院顺义医院 心内科， 北京 101300)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多种原因导致心肌细胞损伤，进而引起心脏射血功能异常，最终导致机体代谢失衡的一种心血管系统终末期疾病[1-3]，患病率已达1.6%，严重地危害人类健康[4]。心室重构是CHF发生发展的基本机制，主要涉及心肌细胞结构功能的异常改变[5-6]。线粒体是心肌细胞重要的细胞器，参与了心室重构重要的环节[7]。既往研究发现，正常生理状态下心肌细胞线粒体能够为机体提供能量，同时受损的线粒体也能够及时被自噬吞噬处理[8]。病理状态下，心肌细胞线粒体功能异常，自噬小体过度激活，导致心肌细胞中线粒体自噬的失衡[9-10]，提示心肌细胞线粒体自噬在CHF进展中发挥着重要作用。泻肺利水合剂是由葶苈子、桑白皮、车前子、赤芍、水红花子、生黄芪、甘草及太子参8味中药组成，其水合剂用于治疗CHF是由首都医科大学附属北京中医医院许心如教授首次提出、并进行了相关机制探讨，认为其可通过“益气活血，泻肺利水”进而达到治疗CHF的目的[10]。此外，泻肺利水合剂可显著提高心衰患者的生存质量，同时具有良好的血流动力学效应[11-12]。因此，本实验研究拟通过构建CHF大鼠，探究泻肺利水合剂对治疗CHF的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选取6～8周雄性SD大鼠60只，体质量200～220 g，购买于北京大学医学部[SCXK(京)2018-0010]，适应性喂养1周。

1.1.2药品和主要试剂 泻肺利水合剂(葶苈子30 g、桑白皮30 g、车前子30 g、赤芍10 g、水红花子15 g、生黄芪30 g、甘草10 g及太子参30 g)由首都医科大学附属北京中医医院合成，阿霉素(批号D1515，美国Sigma)，自噬微管相关蛋白轻链3抗体(microtubule associated protein light chain 3，LC3)和p62抗体(美国CST)，细胞色素C氧化酶Ⅳ抗体(cytochrome c oxidase IV antibody，COX Ⅳ)、一抗和二抗稀释液、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(江苏碧云天)。

1.1.3主要仪器 H1850高速离心机(美国Thermo Scientific)，H22539细胞涡旋仪(武汉维塞尔)，DW-86L578J -80 ℃超低温冰箱(青岛海尔)，FYL-YS-128 4 ℃、-20 ℃冰箱(合肥美菱)，H22820脱色摇床(江苏盛蓝)，SuPerMax-3100多功能酶标仪(美国Thermo赛默飞世尔)，SKFH-1600RW高速台式冷冻离心机(湖南湘仪)，NIB900-FL荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯)，125-0098电泳仪检测装置(美国Bio-Rad)，CSB-20L高纯水机(美国Millipore)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及造模 60只SD大鼠随机分为对照组(Control组)、模型组(Model组)及泻肺利水合剂药物处理组(treatment组，TM组)，每组20只。Model组及TM组大鼠给予2.0 g/L阿霉素(生理盐水配置)，以2.0 mL/kg腹腔注射、1次/周、连续6周；TM组大鼠系给予泻肺利水合剂[10 mL/(kg·d)]灌胃，1次/d、连续6周；Control组及Model组大鼠给予等量的生理盐水灌胃处理，1次/d、连续6周。

1.2.2心脏超声检测 最后一次灌胃结束后，大鼠取平卧位固定，将探头放置于胸骨左缘，取左室长轴最大直径M超声记录室间隔、左室后壁收缩末期及舒张末期心内膜位置，于结束时采用小动物超声仪器检测大鼠左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVSD)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)，以LVFS<40%或LVEF<50%判定大鼠是否造模成功[13]；利用计算机自带操作软件计算LVDD、LVSD、LVFS和LVEF值。上述操作均由同一操作员进行。

1.2.3酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 心脏超声检测结束时，各组大鼠使用10%的水合氯醛按照4.5 mL/kg腹腔麻醉，采用手术剪和手术镊打开胸腔，剪开左心耳，剪下大鼠心尖组织、生理盐水中清洗并于液氮罐内留存备用；实验时取各组大鼠同等质量的心尖组织研磨成组织匀浆，采用二辛喹酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定心尖组织蛋白质总浓度后，分别通过ELISA检测心尖组织中SOD、ROS和MDA含量。

1.2.4Western blot 分别取各组大鼠心尖组织进行蛋白提取并测定浓度、电泳、转膜，孵育COX Ⅳ一抗(1 ∶1 000)、p62一抗(1 ∶1 000)和LC3(1 ∶1 000)4 ℃过夜，洗膜，室温孵育COX Ⅳ和p62的鼠二抗，LC3的兔二抗1 h；摇床摇晃加TPBS洗涤3次，5 min/次，加显影液显影并拍照，蛋白表达量以各目标条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示。

1.2.5心肌线粒体自噬 取各组大鼠包埋的心肌组织采用超薄切片机进行切片，厚度100 nm，经醋酸双氧铀和柠檬铅染色，透射电子显微镜观察心肌线粒体形态以及自噬小体并对其拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LVEF、LVFS、LVDD和LVSD

与Control组相比，Model组与TM组大鼠的LVEF和LVFS水平明显降低，LVDD和LVSD则明显升高(P<0.01)；与Model组相比，TM组大鼠的LVEF和LVFS水平升高，LVDD和LVSD则降低(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠LVEF、LVFS、LVDD和Tab.1 Comparison of LVEF, LVFS, LVDD, and LVSD in each

2.2 MDA、ROS和SOD

与Control组相比，Model组和TM组大鼠心肌组织中MDA和ROS水平明显升高、SOD水平则明显降低(P<0.01)；与Model组相比，TM组大鼠心肌组织MDA和ROS水平降低、SOD水平则升高(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织MDA、ROS和SOD的比较Tab.2 Comparison of MDA, ROS and SOD level of myocardial tissues in each group

2.3 心肌组织线粒体自噬相关蛋白的表达

与Control组相比，Model组大鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和COX Ⅳ表达均升高、p62表达明显降低(P<0.05或P<0.01)；与Model组相比，TM组大鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和COX Ⅳ表达均降低、p62表达增加(P<0.05)。见图1。

注：与Control组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)与Model组相比，P<0.05。图1 各组大鼠线粒体自噬相关蛋白的表达Fig.1 The expression of mitochondrial autophagy-related proteins in each group

2.4 心肌组织线粒体自噬的形态学特征

Control组大鼠心肌线粒体形态正常、膜完整且无明显的自噬体小泡，Model组大鼠心肌线粒体形态大小不一、膜破裂且有明显的自噬小泡形成，TM组大鼠心肌线粒体膜部分损伤、破裂且有少量的自噬小体形成；与Control组相比，Model组大鼠心肌组织线粒体自噬数量增加，差异有统计学意义(P<0.01)，但Control组与TM组比较、差异无统计学意义(P>0.05)；与Model组相比，TM组大鼠心肌组织线粒体自噬数量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：箭头表示自噬小体；(1)与Control组相比，P<0.01；(2)与Model组相比，P<0.05。图2 各组大鼠的心肌组织线粒体自噬(透射电镜，×10 000)Fig.2 Mitophagy of myocardial tissues in each group (transmission electron microscope,×10 000)

3 讨论

CHF在中医上可以归属为“喘证”、“心水”、“心悸”、“痰饮”等范畴，患病率与年龄呈现正相关，伴随我国人口老龄化的加剧，CHF的患病率逐年提升，已成为我国重要的公共健康问题[14]。以往研究发现，中医药在治疗CHF中发挥重要优势，主要归为中医药中“中成药制剂治疗”、“中药汤剂辩证治疗”、“中药注射剂治疗”以及“其他辅助性治疗”[15]。其中中药汤剂治疗在CHF患者中占据重大部分。温阳利水、益气活血利水、益气养阴以及益气健脾等是中药汤剂治疗CHF的主要机理[16-19]。但是目前有关中药汤剂治疗CHF的主要机制尚不清楚。因此，探寻中药汤剂治疗CHF的可能机制尤为关键。

泻肺利水合剂是由葶苈子、桑白皮、车前子、赤芍、水红花子、生黄芪、甘草及太子参共计8味中药组成，具有典型的益气活血利水功效[10]。研究发现，在气虚水饮内停型心衰患者中采用泻肺利水合剂能够有效改善患者血流动力学特征，提高患者生存质量[11]。但是截止到目前有关泻肺利水合剂的研究主要侧重于临床治疗，有关其在体动物研究以及分子作用机制研究缺乏。本研究主通过腹腔注射阿霉素构建CHF大鼠模型，泻肺利水合剂10 mL/(kg·d)连续灌胃处理6周，结果显示Model组大鼠LVEF和FS水平分别较Control组和TM组降低，但LVDD和LVSD升高(P<0.05或P<0.01)，表明泻肺利水合剂能够改善CHF大鼠心脏功能。

心肌组织氧化应激和线粒体自噬在CHF中发挥重要作用[14]。研究发现，在CHF大鼠和患者中，心肌氧化应激水平均显著增加[20]；抑制心肌组织氧化应激能够有效改善CHF大鼠症状[21]。本实验结果发现，Model组大鼠心肌组织MDA和ROS水平分别较Control组和TM组升高，但SOD水平降低(P<0.05或P<0.01)，提示过度氧化应激会引起心肌细胞线粒体损伤。以往研究也证实受损的线粒体会激活细胞自噬的产生，导致心肌功能的紊乱[22-24]。在CHF大鼠模型中心肌线粒体损伤明显加重，通过给予参葵颗粒能够激活AMPK信号通路，改善心肌细胞线粒体自噬水平[25]。在临床研究20例心衰患者，采用辅酶Q10补充治疗能够有效改善线粒体功能障碍，从而降低心肌氧化应激水平[26]。为此，本研究通过Western blot检测了线粒体自噬相关蛋白。结果显示，Model组大鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和COX Ⅳ表达分别较Control组和TM组升高，p62表达降低(P<0.05或P<0.01)。透射电镜观察结果发现，Control组大鼠心肌线粒体形态正常，膜完整，无明显的自噬体小泡；Model组大鼠心肌线粒体形态大小不一，膜破裂，有明显的自噬小泡形成；TM组大鼠心肌线粒体膜部分损伤，破裂，且有少量的自噬小体形成。

综上所述，泻肺利水合剂可通过降低CHF大鼠心肌组织氧化应激水平，抑制心肌线粒体自噬产生，最终改善心脏功能，从而为泻肺利水合剂用于临床CHF治疗提供了新的理论基础。