槲皮素对PGN诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞炎性损伤的作用及其机制研究

刘 萍，卞艺斐，钟 佳，周期律，刘钟杰

(1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.中国农业大学动物科技学院，北京 海淀 100193)

槲皮素是一种广泛存在于多种中草药中的天然黄酮类化合物，有良好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和维持血管通透性等生物学活性。在肠源性感染性疾病的病程中，微血管内皮细胞的保护和修复，发挥着重要的作用。在这个过程中，Toll样受体2(Toll like receptor,TLR2)介导肽聚糖(Peptidoglysean,PGN)诱导的信号通路，它通过激活MyD88信号通路，激活NF-κB、p38 MAPK、JNK1/2等一系列与炎症反应相关的核转录因子[1]，刺激细胞分泌TNF-α、IL-6等一系列炎性细胞因子和趋化因子，参与炎症反应，引起微血管内皮细胞的损伤。本研究应用PGN诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(Rat intestinal mucosal microvascular endothelial cells，RIMMVECs,RIMMVECs)炎性损伤模型，探究槲皮素对RIMMVECs炎性损伤的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品 槲皮素标准品(Z100081)，购自国家食品药品检定研究院。

1.2 主要试剂 高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶，均购自Biological Industries公司；PGN(69554)，购自Sigma公司；CCK8试剂盒(CK04)，购自东仁化学科技公司；大鼠肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA试剂盒(438204)，购自BioLegend公司；RNA快速提取试剂盒和反转录试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；qPCR Supermix，购自北京全式金生物技术有限公司；TLR2、TLR4、MyD88大鼠单克隆抗体，均购自Abcam公司。

1.3 引物设计 从GenBank中查阅大鼠TLR2、TLR4基因序列，利用Primer Premier 5.0设计软件进行引物设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目的基因引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 主要仪器 高速离心机(美国Scilogex公司)；实时荧光定量PCR仪(罗氏诊断产品有限公司)；酶标仪(Thermo Scientific公司)；蛋白电泳仪、电泳槽(BIO-RAD公司)。

1.5 方法

1.5.1 RIMMVECs细胞培养 按照参考文献[2]所述培养RIMMVECs细胞。

1.5.2 槲皮素作用浓度的筛选 RIMMVECs细胞以1.5×104/孔接入96孔细胞培养板中，待长至70%～80%单层融合状态，吸弃培养基，加入不同浓度含槲皮素培养基，培养24 h后吸弃药液，加入含10% CCK8的DMEM培养基，37 ℃避光培养2 h。450 nm波长检测吸光度。

1.5.3 试验分组与处理 RIMMVECs细胞以5×105/瓶接入25 cm2细胞培养瓶，待细胞长成单层融合状态，进行分组处理。(1)空白对照组(CON，空白培养基24 h+空白培养基6 h)；(2)模型对照组(PGN，空白培养基24 h+15 μg/mL PGN培养基6 h)；(3)80 μmol/L浓度槲皮素作用+PGN组(QUE 80 μmol/L，80 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/mL PGN培养基6 h)；(4)40 μmol/L浓度槲皮素作用+PGN组(QUE 40 μmol/L，40 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/mL PGN培养基6 h)；(5)20 μmol/L浓度槲皮素作用+PGN组(QUE 20 μmol/L，20 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/ml PGN培养基6 h)；(6)10 μmol/L浓度槲皮素作用+PGN组(QUE 10 μmol/L，10 μmol/L槲皮素24 h+15 μg/mL PGN培养基6 h)。

1.5.4 细胞TLR2、TLR4 mRNA水平的测定 收取细胞，参照RNA快速提取试剂盒和反转录试剂盒说明书进行RNA提取和反转录。采用FQ-PCR对细胞TLR2、TLR4 mRNA水平进行测定。反应体系20 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L，0.4 μL)、PCR Reverse Primer (10 μmol/L，0.4 μL)、cDNA 0.8 μL、ddH2O(8.4 μL)和qPCR Supermix(10 μL)。使用实时荧光定量PCR仪，按照反应程序(94 ℃预变性30 s后，94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，重复40个反应循环)进行扩增，计算mRNA相对表达水平。

1.5.5 细胞TLR2、TLR4、MyD88蛋白水平的测定 细胞经2.3步骤处理后，收集上清用于炎性因子TNF-α测量。冷PBS洗2次，细胞刮收集细胞，裂解后提取总蛋白。按参考文献[3]所述进行蛋白免疫印记，测定TLR2、TLR4和MyD88蛋白表达水平。

1.5.6 细胞TNF-α分泌量的测定 取步骤2.5收集的细胞上清，根据大鼠TNF-α ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.5.7 数据处理 IBM SPSS17.0软件对试验结果进行分析处理。试验数据以平均值±标准误(mean ± SEM)表示，单因素方差分析(One-way ANOVA)检验试验组间差异性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素对RIMMVECs细胞活力的影响 由图1可知，相对于空白对照组，160 μmol/L槲皮素组细胞活力显著降低(P<0.05)，80、40、20、10、5、2.5 μmol/L和1.25 μmol/L槲皮素作用组细胞活力无明显变化(P>0.05)。因此，选择80、40、20 μmol/L和10 μmol/L为下一步试验的槲皮素作用浓度。

图1 槲皮素对RIMMVECs细胞存活率的影响Fig.1 Effect of quercetin on RIMMVECs viability*：与空白对照组(槲皮素浓度为0 μmol/L)比较，P<0.05*:Compared with control group (quercetin=0 μmol/L)，P<0.05

2.2 槲皮素对TLR2、TLR4 mRNA水平的影响 由图2可知，PGN刺激后，TLR2和TLR4 mRNA水平显著增加(P<0.05)，相对于模型对照组，80、40、20 μmol/L和10 μmol/L槲皮素预处理能显著降低PGN刺激的RIMMVECs细胞的TLR2 mRNA水平(P<0.05)，而80、40 μmol/L和20 μmol/L槲皮素预处理能显著降低PGN刺激的RIMMVECs细胞的TLR4 mRNA水平(P<0.05)，10 μmol/L槲皮素预处理对TLR4 mRNA水平作用不明显(P>0.05)。

2.3 槲皮素对TLR2、TLR4和下游MyD88 蛋白表达水平的影响 由图3可知，PGN刺激细胞后，TLR4和MyD88蛋白表达水平显著增加(P<0.05)，TLR2和TLR4总表达量显著升高(P<0.05)。对于模型对照组，80 μmol/L和40 μmol/L槲皮素预处理能显著降低TLR2、TLR4和MyD88蛋白表达水平(P<0.05)。

图2 槲皮素对TLR2、TLR4 mRNA水平的影响Fig.2 Effect of quercetin on TLR2 and TLR4 mRNA expression*：与空白对照组比较,P<0.05；#：与模型对照组比较,P<0.05；下图同*:Compared with control group,P<0.05;#:Compared with PGN group,P<0.05.The same as the following figures

2.4 槲皮素对炎性因子TNF-α分泌水平的影响 由图4可知，PGN刺激RIMMVECs细胞后，其TNF-α分泌水平显著升高(P<0.05)。相对于模型对照组，80、40 μmol/L和20 μmol/L槲皮素预处理均能显著降低RIMMVECs细胞的TNF-α分泌量(P<0.05)。

3 讨论

槲皮素是多种中药的主要有效成分之一，有良好的抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和神经保护[4-6]等作用，在畜牧兽医领域具有较好的应有价值。我们之前的研究已表明，中药马齿苋水提液能有效保护试验性结肠炎大鼠，显著降低肠炎疾病活动指数，并抑制结肠TLR4及其介导的通路表达[7]。LPS和PGN等致病因子在结肠炎进展中起重要作用[8]。我们已通过前期研究发现，作为马齿苋的主要有效成分，槲皮素能有效保护LPS诱导的RIMMVECs炎性损伤[2]。然而，槲皮素对PGN诱导的RIMMVECs炎性损伤的作用及其作用机制还未有相关报道。本研究中，利用PGN诱导RIMMVECs细胞造成炎性损伤模型，从内皮细胞炎性损伤层面上评估了槲皮素在肠源性感染性和细菌性疾病进程中的作用。

PGN，又称肽聚糖，是革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁的主要成分[9]。作为TLR2的配体，PGN能激活单核、巨噬细胞和内皮细胞的TLR2、TLR4蛋白表达[10]，释放多种细胞因子，进一步诱发炎症反应。在本试验中，先通过CCK8法筛选出了合适的槲皮素作用浓度(80、40、20 μmol/L和10 μmol/L)。基于此，发现不同浓度的槲皮素能显著降低TLR2、TLR4蛋白mRNA水平，降低TLR2、TLR4及下游MyD88蛋白表达，降低炎性因子TNF-α释放量(P<0.05)。

图3 槲皮素对TLR2、TLR4和下游MyD88 蛋白表达水平的影响Fig.3 Effect of quercetin on TLR2,TLR4 and MyD88 protein expression

图4 槲皮素对炎性因子TNF-α分泌水平的影响Fig.4 Effect of quercetin on TNF-α secretion

在肠道炎症反应中，微血管内皮细胞不仅承担了通常意义上的屏障作用，也是多种细菌致病产物的作用靶点，参与了多种细胞因子分泌过程[11]。在PGN由肠腔进入肠黏膜微血管循环时，肠黏膜微血管内皮细胞发生炎性损伤，并诱发进一步的瀑布式炎症级联反应。本试验证明了槲皮素可以通过调控TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表达抑制PGN诱导的RIMMVECs细胞分泌TNF-α，从而抑制细胞的炎性损伤。本项研究证明，槲皮素能保护PGN导致的肠黏膜微血管内皮细胞炎性损伤，但槲皮素在肠源性疾病中其他层面的作用尚待进一步研究。