改良索氏提取装置提取艾叶中的挥发性成分

孔维松， 许 永， 李 晶， 刘 欣，王 晋， 黄海涛， 杨叶昆，李雪梅， 杨光宇

(云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650106)

艾叶是重要的医药和香料工业原料，有温经止血、散寒止痛、调经安胎的作用[1]。艾草植株香气浓烈，因其香韵独特，可用于日用或食用香精的调配。艾叶中的主要有效成分包括挥发油、黄酮类、鞣质类和多糖等[2-6]。利用艾叶制备的艾叶精油或浸膏添加到烟叶中，可在不影响卷烟燃烧的同时柔和卷烟烟气，降低卷烟杂气，赋予卷烟特殊的风味。众所周知，有效提取和定性定量分析烟用香精香料中的挥发性和半挥发性成分，总结出该香精香料样品的色谱指纹图谱特征，就能得到在所有种类香精香料中代表其特有化学组分的指纹图谱，从而达到质量控制的目的。因此，对烟用香精香料中挥发性和半挥发性成分进行准确的定性和定量分析具有非常重要的意义。

关于植物中的挥发性及半挥发性成分，目前常用的提取方法有溶剂萃取法[7]、同时蒸馏萃取法[8-10]、超临界流体萃取法[11]、固相微萃取法[8-10，12]、顶空气相色谱法[13]和吹扫捕集热脱附解吸法[14]等，其中，顶空气相色谱法、吹扫捕集热脱附解吸法因分析结果重现性较差，多用于定性分析；同时蒸馏萃取中部分不稳定组分长期和热水反应会发生热分解；溶剂萃取法因具有操作简单、经济实用、提取效率高等优点得到广泛使用。固体物质的溶剂萃取通常采用冷浸法或索氏提取法 (热浸法)，冷浸法是靠溶剂长时间的浸润溶解从而将固体物质在溶剂中的可溶物质浸提出来；索氏提取法 (热浸法)是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质被纯溶剂持续提取，但在提取过程中大量杂质会随挥发性成分一起溶出，影响样品分析结果，而且在提取过程中很难避免挥发性成分损失。

综上所述，现有植物挥发性及半挥发性成分的提取方法均无法满足艾叶中挥发性及半挥发性成分的准确分析和客观评价要求。为此，对样品前处理方法进行改进和对索氏提取的方法进行改良后提取艾叶中的挥发性成分，以期为艾叶的挥发性及半挥发性成分提取提供快速、可靠的分析方法，并为其挥发性成分的质量控制提供强技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 艾叶，购于云南当地市场。

1.1.2 仪器 高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；Agilent 6890-5973N气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司； ME414S型电子天平(感量0.000 1 g)，德国Sartorius公司； SJIA-5FE小型视频冷冻干燥机，宁波双嘉。

改良索氏提取装置的部件：烧瓶1，烧瓶1上设有第1接口3、第2接口4和螺纹接口2，烧瓶1通过第1接口3与隔热导气管5气流导通连接，隔热导气管5另一端与三通转接管7气流导通连接，三通转接管7的另外2个接口分别与密闭冷凝管10和样品筒8气流导通连接，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，样品筒8远离三通转接管7的一端设有筛板12并与固相萃取柱9气流导通连接，固相萃取柱9的另一端通过溶剂回流管6与第2接口4气流导通连接，溶剂回流管6内设有三通阀13(图1)。

带固相萃取功能的索氏提取装置的工作过程：样品分析时，于固相萃取柱9中加入硅胶颗粒，在样品筒8中装入称量好的样品，在样品上方覆盖1层无水硫酸钠(用于除去溶剂及管道内的水分)，将样品筒8与固相萃取柱9密封连接，在烧瓶1中加入回流提取的溶剂(二氯甲烷)，将固相萃取柱9通过溶剂回流管6与第2接口4密封连接，将隔热导气管5与第1接口3密封连接，将三通转接管7的3个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后将烧瓶1置于水浴锅或油浴锅中加热冷凝回流。样品提取过程中，溶剂回流管6的三通阀13与第2接口4气流导通，挥发的溶剂将固相萃取柱9中所提取的待测样品回流至烧瓶1中，当样品提取完毕后，把三通阀13调整为与外界空气导通的状态，不断挥发的溶剂通过三通阀13流出并回收，此时烧瓶1中的溶液不断被浓缩直至溶剂蒸发完，即可进行色谱检测。

1.1.3 试剂 二氯甲烷(色谱纯)，美国Dicma公司；柱色谱硅胶(200～300目)，青岛海洋化工厂；无水硫酸钠(AR)，天津化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 于固相萃取柱9内填充20 g硅胶颗粒，然后称取冷冻干燥并粉碎后的待测样品5.0 g于样品筒8中；将放置有样品的样品筒8与带有固相萃取功能的索氏提取装置的其他部分密封连接；于烧瓶1中加入200 mL二氯甲烷溶剂，然后将上述装置放入水浴锅中于50℃下加热回流2.5 h。样品提取完毕后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1尾管中的样品溶液蒸发至约1 mL，浓缩好的样品准确定容到5.0 mL，用0.45 μm的针头过滤器过滤，滤液进行GC-MS分析。

1.2.2 提取试剂的选择 采用改良的带固相萃取功能的索氏提取装置提取艾叶样品，分别用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷 3种不同极性的溶剂提取，对比提取液的 GC-MS总离子流图。

1.2.3 提取时间的优化 按1.2.1的样品前处理方法，采用改良的带固相萃取功能的索氏提取装置分别提取艾叶样品1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，分析对比不同提取时间得到的提取液的 GC-MS总离子流图。

1.2.4 固相萃取填料用量的选择 索氏提取法在提取过程中大量杂质会随挥发性成分一起溶出，因此研究对传统索氏提取装置进行改进，于索氏提取装置中增设了固相萃取柱，采用硅胶作为固相萃取填料以吸附提取液中的杂质，并对硅胶的用量进行了优化。分别于改良的带固相萃取功能的索氏提取装置的固相萃取柱中放置10 g、20 g、30 g、40 g硅胶颗粒(30～60 μm)，分析对比提取液的 GC-MS总离子流图。

1.2.5 色谱条件 DB-5 MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样量1.0 μL，柱流量1.0 mL/min，分流比为10∶1，进样口温度260℃。程序升温条件：初始温度50℃，保持2 min；再以5℃/min 速率升至220℃；再以10℃/min速率升至250℃，保持10 min。

1.2.6 质谱条件 电子轰击离子源为E1；离子化电压70 eV，离子源温度230℃；传输线温度280℃，质量扫描范围50～350 amu。

1.2.7 系统方法学考察

1) 重现性。从艾叶挥发性成分中含量最高的烯类化合物、醇类化合物和酮类化合物中选择有代表性的石竹烯、4-萜烯醇和2-莰酮3种组分，在同一天内平行测定7次，计算日内相对标准偏差；相同样品每天测定1次，连续测定5 d，计算日间相对标准偏差。

2) 检出限。选择不同挥发性的3种组分苯乙酮、石竹烯和棕榈酸酯考察方法的检出限。配制浓度为0.1 μg/mL的3种物质的混合标液，平行进样10次，以10次测定结果的标准偏差的3倍计算得到3种物质的的检出限。

2 结果与分析

2.1 提取试剂

试验结果表明，乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3种提取试剂中，二氯甲烷溶剂萃取到的化学成分种类最多，色谱峰面积较大，故选用二氯甲烷作为提取溶剂。

2.2 提取时间

试验表明，提取2 h后，总离子流图中化学成分种类及色谱峰面积基本保持不变，为保证目标物提取完全，试验选择提取时间为2.5 h。

2.3 固相萃取填料用量

当硅胶用量为10 g时，提取液总离子流图中化学成分种类及色谱峰面积明显小于其他3种硅胶用量；硅胶用量为20 g和30 g时，提取液总离子流图中化学成分种类及色谱峰面积没有明显变化；硅胶用量为40 g时，提取液总离子流图中化学成分种类及色谱峰面积略低于20 g和30 g的硅胶用量，可能是由于硅胶用量较大时吸附了部分挥发性成分。为实现提取液的有效净化，选择固相萃取填料的用量为20 g。

2.4 艾叶挥发性成分

从表1可知，艾叶的二氯甲烷提取物中共鉴定出 62种成分，主要包括烯类、醇类、酮类、醛类、有机酸等。其中，烯类化合物最多，为19 种，总含量为30.05%，含量较高的成分主要有石竹烯(5.94%)、3-蒈烯(3.96%)、反-β-法尼烯(3.18%)、[S-(R*，S*)]-3-(1，5-二甲基-4-己烯基)-6-亚甲基-环己烯(2.94%)、6，10-二甲基-3-(异丙基亚基)-1-环癸烯(2.74%)、(1R，3E，7E，11R)-1，5，5，8-四甲基-12-氧杂二环[9.1.0]十二-3，7-二烯(2.46%)和律草烯含量较高的成分主要有桉树脑(2.75%)、(-)-桃金娘烯醇(2.31%)、(1R，7S，E)-7-异丙基-4，10-二亚甲基环癸-5-烯醇(2.04%)、4-萜烯醇(2.00%)和10，10-二甲基-2，6-二亚甲基二环[7.2.0]十一烷-5β-醇(1.99%)等；酮类化合物有7种，总含量为12.51%，含量较高的成分主要有2-莰酮(4.50%)、刺柏烯酮(2.31%)、3，3，6-三甲基-1，5-庚二烯-4-酮(1.99%)、3-甲基-6-异丙基-2-环己烯-1-酮(1.83%)、4-(1，5-二甲基己-4-烯基)环己-2-烯酮(1.76%)、D-香芹酮(1.42%)、4-羟基-3-甲基苯乙酮(1.25%)等；有机酸有3种，均为长链不饱和脂肪酸；此外，还有少量酚类化合物 (3种)、醛类化合物(2种)、酯类化合物(1种)及其他化合物(10种)。

表1 艾叶提取物中的挥发性成分Table 1 Volatile components in A. argyi extract

续表1

2.5 艾叶香味成分

从表2可知，艾叶提取物中有26种香味成分，占挥发性物质相对质量的 41.51%。其中，石竹烯被GB 2760-1996批准为允许使用的食品香料，可用于调配丁香、胡椒、肉豆蔻、柑橘、药草等食用香精，也可用于合成其他香料；2-莰酮具有樟木气味，可用于配制薄荷、白柠檬和果仁等食品香精，以及配制花露水、日用化妆品等日用香精；桉树脑(醇)具有与樟脑相似的气味，可用于药草型香精；3-蒈烯具有强烈的松木样香气，可用于多种食用香精中，亦可作合成香料的原料，这些香味成分协调配伍，赋予了艾叶特殊的香气。

表2 艾叶提取物中的挥发性香味成分Table 2 Volatile aroma components in A. argyi extract

2.6 方法重现性和检出限

从表3可知，4-萜烯醇的日内和日间RSD分别为3.40%和3.72%；2-莰酮的日内和日间RSD分别为3.53%和4.00%；石竹烯的日内和日间RSD分别为3.14%和3.64%。可见方法重现性较好。

表3 艾叶部分挥发性成分的日间与日内重复性Table 3 Day-to-day and intra-day repeatability of some volatile components in A. argyi %

经计算，苯乙酮、石竹烯和棕榈酸酯的检出限分别为0.140 μg/mL、0.210 μg/mL和0.130 μg/mL。说明方法灵敏度较高。

3 结论与讨论

研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置可在密闭条件下对样品进行分离、提纯、浓缩，无需如传统的分离提纯、浓缩需要多次转移、浓缩的操作步骤，大大提高了提取效率；此外，该装置采用全封闭的冷凝管，有效避免提取溶剂的挥发损失，大大降低样品前处理过程对实验室环境造成的污染，密闭冷凝器带有泄压阀，压力过高时可自动泄压，有效避免了可能因压力过高对提取装置造成的损坏；装置在溶剂回流管中设置三通阀，通过切换阀门可直接切换样品回流提取和浓缩，整个操作流程不需要转移样品；此外，装置中还设计了连接色谱进样瓶接口的圆底烧瓶，样品浓缩完成后，旋下色谱进样瓶即可直接进行分析，避免了常规样品尾管浓缩烧瓶浓缩完后需用吸管把尾管中溶液取出并洗涤尾管和吸管的步骤。进一步简化了样品前处理操作。

研究利用改良的带固相萃取功能的索氏提取装置提取艾叶中的挥发性成分，采用GC/MS 联用技术分析鉴定出 62种挥发性组分，其中具有香味的成分有26 种。此外，艾叶提取物中的一些挥发性物质还具有一定的药用活性，如o-百里香素有防、杀昆虫和杀真菌作用，其杀真菌活性比标准抗真菌抗生素更强；桉树脑具有解热、消炎、抗菌、防腐、平喘及镇痛作用。艾叶挥发性成分与樟脑组成的复方临床上可用于治疗头痛；2-莰酮可用作防蛀剂、防腐剂以及制造火药、医药、香料、焰火等；冰片可用于目赤肿痛，喉痹口疮、用于疮疡肿痛，溃后不敛等；(反)-β-法尼烯是蚜虫的报警信息素，将(反)-β-法尼烯与常规杀虫剂混用，将驱使蚜虫主动接触杀虫剂，在动态中被灭杀；石竹素在医学中用于治疗病毒性迁延性慢性肝炎，对症状、体征和肝功能均有明显的改善作用，也尚有纠正蛋白代谢障碍的作用。这些成分可用于香精、香料及制药，具有很高的开发利用价值。