海南植烟区烟田烟粉虱隐种分布和系统发育分析

李 萌，夏长剑，邵 雨，薛国喜，贺 远，王天玉，吕洪坤，陈德鑫*

1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道136 号 450001 2. 中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所，海口市红城湖路22 号 571100 3. 海南省烟草公司儋州市公司，海南省儋州市那大镇中兴街中段 571700

烟粉虱（Bemisia tabaci）是我国烟草上的重要害虫，主要以刺吸植物汁液、分泌蜜露诱发煤污病及传播烟草曲叶病毒病（Tobacco leaf curl disease，TLCD）3 种方式为害烟草，尤其以传播曲叶病毒病造成的损失最为严重［1-4］。烟粉虱的分类地位一直存在争议，目前普遍认为烟粉虱在形态上很难区分，但在抗药性、寄主适应性及传毒效率等生物学特性上存在明显差异，是多个隐种构成的复合种［5］。臧连生等［6］研究发现入侵的烟粉虱隐种MEAM1 对吡虫啉和吡丙醚的敏感性均低于土著烟粉虱隐种Asia II 3。Jiu 等［7］比较了入侵和土著烟粉虱在烟草（品种为NC89）上的生殖力和寿命，发现入侵烟粉虱隐种MEAM1 在烟草上的寿命和产卵量均显著高于土著烟粉虱隐种Asia II 3。Liu等［8］发现入侵烟粉虱隐种MEAM1 可高效传播烟草曲叶病毒病病原中国番茄黄化曲叶病毒，而入侵烟粉虱隐种MED 却不能传播该病毒。由于不同烟粉虱隐种在重要生物学特性上差异显著，烟粉虱隐种类型的准确鉴定已成为制定有效防治技术的基本前提。尽管已有许多研究报道了烟粉虱对烟草的为害［9-12］，但对烟田烟粉虱隐种进行鉴定的报道却不多。饶琼等［13］报道湖北武汉烟草上发生的烟粉虱隐种为MEAM1；赵瑞华等［14］报道陕西延安烟草上发生的烟粉虱隐种为MEAM1 和MED；Jiu 等［15］报道河南许昌烟草上发生的烟粉虱隐种为MED。海南是我国雪茄烟叶的主要产区和重要的烟草南繁育种基地，由于以往烟草栽培面积有限，海南烟草病虫害的普查工作较为滞后，海南烟草上烟粉虱危害状况的研究尚鲜见报道，其隐种类型也不清楚。因此，为明确海南烟草上烟粉虱的发生状况和隐种分布，调查了海南省主要植烟区烟田烟粉虱及其传播曲叶病毒病的发生程度，并应用线粒体COI基因PCR-RFLP 和系统发育分析对烟粉虱隐种类型进行了鉴定，旨在为了解海南烟草上烟粉虱隐种多样性及对烟粉虱进行综合治理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料从海南省儋州、屯昌和澄迈的雪茄烟田及三亚、乐东烟草南繁育种基地采集的烟粉虱样品。

1.1.2 试剂

2×Taq Plus Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA 聚合酶、Taq I 内切酶、蛋白酶K、帕拉膜和琼脂糖等购自生工生物工程（上海）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3 仪器

Vetiti 型 梯 度PCR 仪（美 国ABI 公 司）；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Mini Bis Pro 型凝胶成像分析系统（以色列DNR 凝胶成像系统有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 田间调查和样品采集

在每块烟田以“Z”字形选取5 个调查点（每点50 株），于2019 年2～4 月调查整株烟草上的烟粉虱成虫数量和烟草曲叶病毒病发病株数，计算发病率。调查过程中用装有无水乙醇的1.5 mL 离心管随机采集活体烟粉虱成虫30～50 头。采集的烟粉虱样品于-20 ℃保存。

1.2.2 烟粉虱基因组DNA 提取

用移液器把单头烟粉虱从无水乙醇中吸至剪成小片的帕拉膜上，待酒精挥发后滴加15µL 裂解液（10 mmol/L Tris，pH 8.4；50 mmol/L KCl，0.45%Tween-20，0.2%Gelatin，0.45%NP40，100µg/mL 蛋白酶K），用0.2 mL 离心管底部充分研磨虫体，将匀浆液吸入0.2 mL 离心管中。吸取10µL 裂解液清洗帕拉膜上的研磨烟粉虱处数次，将清洗液与匀浆液合并。将含烟粉虱提取液的0.2 mL 离心管置入PCR 仪中65 ℃孵育30 min，然后95 ℃10 min灭活蛋白酶K 即完成烟粉虱基因组DNA 提取。提取的烟粉虱基因组DNA 于-20 ℃储存。

1.2.3 线粒体COI基因PCR-RFLP 鉴定

每个采样点随机挑选30 头烟粉虱，参考秦丽等［16］描述的线粒体COI基因PCR-RFLP 技术鉴定烟粉虱隐种。以烟粉虱基因组DNA 为模板，应用通用引物C1-J-2195（5'-TTGATTTTTTGGTCATCC AGAAGT-3'）和TL2-N-3014（5'-TCCAATGCACTA ATCTGCCAT ATTA-3'）扩增烟粉虱线粒体COI基因片段（866 bp）。PCR 反应体系（20µL）为：烟粉虱基因组DNA 2µL，2×Taq Plus Master Mix 10µL，10µmol/L 上下游引物各0.5µL，ddH2O 7µL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1.5 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环，最后72 ℃延伸10 min。取PCR 产物进行酶切，酶切反应体系（10 μL）为：10×Buffer 1 μL，Taq I内切酶（10 U）1 μL，PCR产物7 μL，ddH2O 1 μL，酶切反应条件为65 ℃1 h。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳（85 V，40 min）后在凝胶成像系统上拍照，参照烟粉虱隐种标准图谱鉴定烟粉虱隐种［16］。

1.2.4 线粒体COI基因测序与序列分析

线粒体COI基因通过PCR-RFLP 隐种鉴定，结果见图1。每个采集点选择2～3 个具有代表性线粒体COI基因PCR-RFLP 谱带的样本，应用1.2.3 节描述方法再次扩增其线粒体COI基因片段。PCR扩增产物送尚亚生物技术有限公司测序，测序结果保存于Genbank（表1）中。应用MEGA 6.0 的邻接法构建系统发育树，并分析海南烟草上烟粉虱隐种和中国境内已知的14 种烟粉虱隐种线粒体COI基因的遗传距离和亲缘关系。

图1 海南澄迈烟粉虱线粒体COI 基因PCR 产物Taq I 酶切图谱Fig.1 PCR products of mitochondrial COI of Bemisia tabaci in Chengmai，Hainan after digested by Taq I

2 结果与分析

2.1 烟粉虱及其传播的烟草曲叶病毒病的发生概况

在儋州、屯昌、五指山和澄迈4 个雪茄烟调查点及三亚、乐东2 个烤烟繁种调查点调查了烟粉虱及其传播的曲叶病毒病发生和为害状况，调查结果（表2）显示，除五指山调查点外，其他调查烟田均发现烟粉虱为害，为害部位主要集中在中下部叶片。澄迈烟粉虱虫株率较低（35%），其虫口密度也最低（0.5 头/株）；儋州、屯昌、三亚和乐东烟粉虱虫株率均大于80%，虫口密度为5～10 头/株。除五指山外，所有发现烟粉虱的烟田均发现了感染烟草曲叶病毒的烟株，病株率为1%～3%，发病植株严重矮化、叶片扭曲，基本丧失经济价值。

表1 序列分析所用线粒体COI 基因序列Tab.1 Mitochondrial COI gene sequences used for sequence analysis

表2 烟粉虱及其传播曲叶病毒病田间调查结果Tab.2 Occurrences of Bemisia tabaci and tobacco leaf curl disease spread by B. tabaci in tobacco fields

2.2 线粒体COI 基因PCR-RFLP 鉴定烟粉虱隐种

5 个采集点共计150 头烟粉虱的线粒体COI基因的TaqⅠ酶切图谱呈现两种类型（图1），与秦丽等［16］报道的烟粉虱MEAM1 隐种和MED 隐种的线粒体COI基因PCR-RFLP 图谱一致，初步表明海南烟草上发生的烟粉虱是入侵烟粉虱MEAM1 隐种和MED 隐种。

2.3 系统发育分析

应用海南12 个烟粉虱和中国境内已报道烟粉虱隐种线粒体COI基因序列构建的系统发育树显示，海南烟田烟粉虱形成了两个分支，分别与入侵烟粉虱隐种MEAM1 隐种和MED 隐种聚为一支，表明海南烟田发生的烟粉虱为MEAM1 隐种和MED 隐种（图2）。多重序列比对发现，海南MEAM1 隐种和MED 隐种的序列相似度为94%，不同地区MEAM1 隐种间的序列相似度为100%，不同地区MED 隐种间的序列相似度均大于99%，见表3。

图2 基于线粒体COI 基因构建的烟粉虱隐种系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Bemisia tabaci cryptic species generated by analysis of mitochondrial COI sequences

表3 海南植烟区烟田烟粉虱隐种线粒体COI 基因序列相似度分析Tab.3 Similarity between mitochondrial COI sequences of Bemisia tabaci collected from different tobacco-growing areas in Hainan （%）

2.4 海南植烟区烟田烟粉虱种群分布

不同采集点烟粉虱隐种鉴定结果如表4 所示。海南儋州、屯昌和乐东烟田烟粉虱种群为MEAM1隐种；澄迈和三亚烟田为MEAM1 和MED 混合发生，MEAM1 所占比例分别为56.7%和83.3%。总体来看，海南烟草上发生的烟粉虱是入侵隐种MEAM1和MED，其中MEAM1为优势隐种。

表4 海南植烟区烟粉虱隐种构成Tab.4 Cryptic species composition of Bemsia tabacci in different tobacco-growing areas in Hainan

3 讨论

烟粉虱MEAM1 和MED 隐种是世界性重要入侵有害生物，主要为害葫芦科、茄科和十字花科蔬果及花卉、棉花、烟草等经济价值较高的作物［17］。海南早在2002 年就有MEAM1 隐种发生为害的报道［18］。海南已报道的烟粉虱隐种包括入侵隐种MEAM1 和MED 及Asia I 、Asia II 1 和China 1 3 个土著隐种［19］。与郭磊等［20］2017 年对海南三亚、澄迈和陵水茄科蔬菜和瓜类上烟粉虱的隐种鉴定结果类似，本研究中发现海南主要植烟区烟草上的烟粉虱为入侵隐种MEAM1 和MED，未发现土著烟粉虱，表明海南省田间发生为害的烟粉虱均为入侵烟粉虱隐种，土著烟粉虱隐种可能已被入侵烟粉虱隐种所取代。海南不同植烟区烟粉虱的隐种构成存在一定差异，儋州、屯昌和乐东烟田烟粉虱种群为MEAM1 隐种，而澄迈和三亚烟田则为MEAM1 和MED 混合发生。由于海南植烟历史较短且多与蔬果产区重叠，推测这些差异可能与烟田周边其他作物上的迁入虫源的隐种构成有关。综合来看，海南主要植烟区烟草上的烟粉虱的优势隐种为MEAM1，有取代MED 隐种成为唯一隐种的趋势。

本研究中还发现烟粉虱在海南植烟区烟草上发生普遍，但虫口密度相对较低，并未对烟株生长发育造成可见为害，整体为害程度较轻。入侵烟粉虱隐种MEAM1 和MED 的寄主范围很广，但其对不同寄主或同一寄主植物的不同品种的适应性存在明显差异［12，21］。田间调查发现，烟粉虱在雪茄烟烟株上的伪蛹和若虫数量均较少，表明栽培的雪茄烟品种可能对烟粉虱的适合性不高。此外，本研究中调查的烟田周边均距蔬菜田较远或有林木隔离，致使虫源迁入较少，这也可能是烟草上虫口密度较低的原因。尽管烟粉虱造成的直接为害并不严重，但有烟粉虱分布的烟田均发现了烟草曲叶病毒病病株，个别地块病株率高达5%，发病烟株基本失去经济价值。由于烟粉虱对烟草曲叶病毒病病原的传播效率较高且可终身携毒［22］，因此，烟叶生产上仍需重视对媒介昆虫烟粉虱的防治。

4 结论

对海南植烟区烟粉虱发生情况进行调查发现，烟粉虱在海南植烟区普遍发生，整体为害程度较轻，但其传播的烟草曲叶病毒病在部分植烟区发生较为严重。应用线粒体COI基因PCR-RFLP和系统发育分析对不同植烟区烟田烟粉虱隐种进行了鉴定，结果显示海南烟草上发生的烟粉虱是入侵隐种MEAM1 和MED，其中MEAM1 为优势隐种。