侵染番茄的曲叶病毒检测及遗传变异分析

田培洁 李诗君 张 宇 刘 勇， 张松柏， 张德咏，*

（1 湖南农业大学植物保护学院，湖南长沙 410120；2 湖南大学研究生院隆平分院，湖南省农业科学院，湖南长沙 410125）

番木瓜曲叶病毒（papaya leaf curl virus，PaLCuV）、广东番茄曲叶病毒（tomato leaf curl Guangdong virus，ToLCGDV）和广西番茄曲叶病毒（tomato leaf curl Guangxi virus，ToLCGXV）均属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），基因组为单链环状DNA，长度为2.5～3.0 kb（Varun et al.，2017）。主要侵染双子叶植物如番茄（Solanum lycopersicum）、番木瓜（Carica papaya）、西番莲（Eclipta prostrata）、木薯（Manihot esculentaCrantz）和棉花（Gossypium）（Huang &Zhou，2006；Zhang et al.，2010），以及杂草如田麻（Corchoropsis timentosa）、胜红蓟（Ageratum conyzoidesL.）和金盏菊（Siegesbeckia orientalisL.）等（蔡建和等，2007；Venkataravanappa et al.，2019）。曲叶病毒侵染作物，造成叶片严重卷曲、畸形，植株矮化，严重影响作物产量和品质（Varun et al.，2017）。

曲叶病毒在自然条件下，仅由烟粉虱传播，且烟粉虱传毒效率高、速度快（Guo et al.，2015）。我国广西、广东、河南、云南、海南、福建和四川等省都有曲叶病毒发生危害的报道（Zhou et al.，2001；Wang et al.，2004；张鲁斌 等，2005；熊艳等，2014；谢丽雪 等，2019），呈现随传播介体烟粉虱快速扩展而快速扩散的趋势，因此，急需开展双生病毒在我国的发生、分布及其危害程度研究，明确其对我国重要经济作物的潜在威胁。

本试验于2017—2019 年，采集了我国5 个省份（甘肃、广西、海南、河北和云南）疑似感染曲叶病毒的番茄样本，采用特异性PCR 及常规测序，检测鉴定曲叶病毒种类，并对PCR 扩增序列进行系统发育和分子进化分析，研究结果可为曲叶病毒的流行分析和致病性研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2017—2019 年，在甘肃、广西、海南、河北和云南等省番茄主产区共采集疑似感染曲叶病毒的病叶168 份。

1.2 叶片总DNA 抽提

叶片总DNA抽提采用CTAB 法（Zhang et al.，2010）。将叶片加入液氮研磨，加入CTAB试剂和氯仿/异戊醇（体积比24∶1）后涡旋振荡，12 000 r · min-1离心5 min 去除沉淀；将水相转移至新管中，加入异丙醇沉淀总DNA，沉淀用ddH2O 溶解后于-20 ℃保存。

1.3 引物设计与合成

采用蔡建和等（2005）设计的特异性引物PA（5 ′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3 ′）和PB（5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′）（其中K=G 或T，W=A 或T，V=A、C 或G，S=C或G，Y=C 或T，R=A 或G，B=C、T 或G），扩增双生病毒基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列之间的DNA-A 部分序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR 扩增和序列测定

PCR 扩增参照Zhang 等（2010）的方法。PCR反应体系（20 μL）包括10 × PCR Buffer 10 μL，上游/下游引物（10 μmol · L-1）各0.5 μL，dNTP Mix 1.0 μL，总DNA 1.0 μL，DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR 反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 35 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1.5 min，35 个 循环；最后72 ℃ 10 min。PCR 产物采用MiniBEST Agarose Gel DNA 纯化试剂盒（Takara）纯化，纯化PCR 片段采用T/A 法克隆到pEASY-T5 载体，重组载体送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 序列拼接与分析

序列同源性分析采用Genbank 的nblast 进行在线分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。采用 MEGA v5 软件构建序列系统发育树，分析序列最大可能性碱基替换（Tamura et al.，2011）。序列重组分析采用RDP v4.101 软件（Martin et al.，2015）进行。

2 结果与分析

2.1 番茄植株田间症状

5 个省份田间普查发现，疑似病毒侵染的番茄植株出现植株严重矮化、叶片向上卷曲、叶片深绿增厚且易脱落、易落花、结果少等症状（图1）。采集所有疑似病毒侵染的番茄植株症状类似的顶部叶片，带回实验室检测。

2.2 曲叶病毒发生率检测

采集的168 份番茄样本特异性PCR 检测结果表明（图2），经PCR 扩增得到与预期一致的特异性条带，大小为600 bp 左右。共有42 份番茄样本检出曲叶病毒，平均检出率为25.00%，其中广西番茄曲叶病毒检出率最高，达到50.91%，甘肃检出率最低，仅为6.67%（表1）。

表1 5 个省份番茄样本感染曲叶病毒检出率

2.3 序列分析及病毒种类鉴定

序列同源性比对结果表明，5 个省份的曲叶病毒序列同源性平均为89.82%。海南省5 个分离物中，HN1、HN3 和HN5 与ToLCGDV同源性最高，达到99.68%以上；HN2 和HN4 与PaLCuCNV 同源性最高，达到97.90%以上。广西分离物之间的同源性相对较低，平均为93.41%，其中GX2～GX5、GX6～GX8 之间的同源性高达99.50%，其他分离物之间的同源性也达98%以上，但两组之间的同源性相对较低。甘肃2 个分离物GS3 和GS11 的同源性高达99.85%，与ToLCGDV同源性最高，达99.21%以上。河北5 个分离物中，HB1 和HB3 的同源性高达99.50%，与PaLCuV BS7 同源性最高；HB2、HB4 和HB5 之间同源性达99.30%以上，与PaLCuV BS6 同源性最高；两组之间同源性相对较低，为93.00%以上。云南分离物序列之间的同源性高达99.50%以上，与ToLCGXV分离物2013 同源性最高，达到99.60%以上。

2.4 序列系统发育分析

序列系统发育分析结果表明，测定的曲叶病毒分离物与Genbank 中我国不同省份曲叶病毒代表性分离物聚为2 个亚簇，亚簇I 包含河北分离物HB2、HB4 和HB5，广西分离物GX1～GX8，海南分离物HN2、HN4，云南分离物YN1、YN2，甘肃分离物GS3、GS11 以及下载的曲叶病毒代表性分离物，亚簇Ⅱ包含5 个省份其他分离物。所有分离物不存在地域依赖性，也没有寄主分化特性（图3）。

2.5 序列重组分析

从表2 可以看出，曲叶病毒共发现8 个重组事件；在测定的序列中，GX9、GX16、GX17、GX20 和GX22 为重组子，其中GX20 的主要序列来源为海南分离物HN1，次要来源为广西分离物GX28，表明我国不同省份间曲叶病毒存在重组现象。

表2 曲叶病毒重组位点分析

2.6 序列碱基替换分析

Genbank 中曲叶病毒分离物序列突变分析结果表明，嘌呤（A/G）的替换/转换率（k1）为2.41，嘧啶（C/T）的替换/转换率（k2）为3.27。基因总体的碱基替换/转换率（R）为1.26，以嘧啶（C/T）的替换/转换为主（18.73）（表3）。

表3 曲叶病毒序列碱基替换分析

3 讨论

自然界中曲叶病毒仅由烟粉虱传播，近年来随着烟粉虱在我国的暴发式扩展危害，曲叶病毒也呈现快速扩散的趋势（肖思 等，2020）。本试验结果表明，我国甘肃、广西、海南、河北和云南等省的曲叶病毒为PaLCuCNV、ToLCGDV 和ToLCGXV，这几种病毒已经在我国西北、西南、华南等地区扩散危害，导致植株严重矮化、叶片卷曲、花果易脱落，降低作物产量，且严重影响农产品的商品性（Varun et al.，2017）。由烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV），也在我国大面积发生危害；曲叶病毒与TYLCV 均为双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），二者侵染番茄产生的症状类似，仅凭田间症状无法区分（王雨蒙 等，2020），因此，急需开展曲叶病毒在我国的分布危害以及致病性等方面的研究，明确其对我国主要经济作物的潜在威胁。

重组和突变在植物病毒的适应性进化中发挥重要作用，也在植物病毒的致病性中发挥重要作用（Trovão et al.，2015）。研究表明，侵染广西和南京地区番木瓜的PaLCuCNV，与中国胜红蓟黄脉病毒（ageratum yellow vein China virus，AYVCNV）、辣椒曲叶病毒（pepper leaf curl virus，PepLCV）及烟草曲茎病毒（tobacco curly shoot virus，TbCSV）有较高的氨基酸同源性，推测这些病毒来源于共同的祖先（蔡建和 等，2005）。此外，云南番茄分离物PaLCuV 分离物YN678 的重组分析结果表明，其为ToLCV 与TYLCV 之间的重组子，重组片段为294～1 295 nt 区域，包含整个AV1 及AC3 部分区域（王玉 等，2010）。据此推测，在寄主和环境因子等选择压力下，重组和突变等适应性分化普遍发生在曲叶病毒之间。本试验重组分析结果表明，曲叶病毒PaLCuV 和ToLCV 之间存在重组现象；且测定的曲叶病毒序列中，5 个广西分离物为重组子，其中分离物GX20 的主要序列来源为海南分离物HN1，次要来源为广西分离物GX28，表明我国不同省份间曲叶病毒存在重组现象。后续开展我国不同省份更多曲叶病毒的序列测定，分析其遗传进化特征，可为分析曲叶病毒对我国主要经济作物的潜在威胁提供科学依据。

研究表明，4 种烟粉虱Middle East-Asia minor 1（MEAM1），Mediterranean（MED），Asia1 和Asia7，传播曲叶病毒的效率都非常高，其中烟粉虱MEAM1 传毒效率最高（Guo et al.，2015）。近年来，烟粉虱MEAM1 和MED 在我国快速扩展危害，其传播的多种病毒在我国也呈现暴发式的扩展危害（王雨蒙 等，2020）。鉴于烟粉虱MEAM1 传播曲叶病毒效率最高，因此，应监测我国烟粉虱携带曲叶病毒的带毒率，加强病毒的监测预警，为曲叶病毒的预警和防控提供科学依据。

4 结论

甘肃、广西、海南、河北和云南等省份番茄主产区采集的疑似感染曲叶病毒的番茄病叶中，曲叶病毒平均检出率为25.00%，其中广西最高，达到50.91%。曲叶病毒的种类鉴定为PaLCuCNV、ToLCGDV 和ToLCGXV。5 个省份的曲叶病毒分离物的测定序列可分为2 个亚簇，无明显的地域特性和寄主依赖性。遗传进化分析表明，5 个省份的曲叶病毒出现5 个重组事件，序列中C/T 替换率最高（18.73）。