以脾胃为中心的葛根相关配伍对糖尿病心肌病大鼠受损心肌线粒体的改善作用*

樊一波，文颖娟，李 蒙，李 静，朱瑞超

1.陕西中医药大学(咸阳712046)；2.宝鸡职业技术学院(宝鸡 721013)

糖尿病心肌病(Diabetic cardio myopathy，DCM)作为糖尿病并发症之一，已成为糖尿病患者最主要的死亡原因[1-2]，目前西方医学对DCM的治疗，用药体系繁杂，这可能与其众说纷纭的药物治疗靶点有关[3-6]。因此深入探讨DCM治疗机制便显得尤为重要，中医学中并没有与DCM相关的记载，但依据其临床表现，发现其与“消渴”“心悸”“胸痹”“胸痛”“真心痛”等具有一定的相似性。而对于以上病症，在中医学中却记载颇多，并发现这些病症存在一定的关联性，同时认为脾胃是对其进行治疗的关键。仝小林教授在长期的临证中对此点进行了印证，认为糖尿病的病理中心在于“胃肠”，糖尿病日久，至疾病晚期，最终由于脾胃虚惫，气血生化乏源，而使并发症丛生[7-8]。同时有文献记载线粒体遍布人体各有氧真核细胞当中，若其结构、功能失常，便会导致人体能量代谢失常，以致影响人体五脏六腑及生命体的正常生理功能，此功能与脾相似度极高，研究发现线粒体的氧化磷酸化产能过程与脾运化功能高度相似[9-10]。由此可见，DCM的发生、治疗可能与线粒体质量关系密切，这与近年来西方医学的相关研究结论不谋而合[11-12]，故认为线粒体质量与DCM存在一定关系，线粒体质量直接影响了DCM的发生发展。因此本次实验以脾胃为中心，研究中医组方对DCM心肌线粒体质量的调控作用，以深入探讨DCM的治疗机制，并通过拆方揭示中医治疗DCM的科学内涵。

材料与方法

1 实验药物 葛根方：葛根10 g；葛芪方：葛根10 g、黄芪 15 g；葛参方：葛根10 g、丹参15 g；葛根与瓜蒌薤白半夏汤组成的葛蒌方：葛根10 g，薤白9 g，全瓜蒌、半夏各12 g；葛根与黄芪、丹参、瓜蒌薤白半夏汤配伍组成的葛芪参蒌方：葛根10 g，黄芪、丹参各15 g，薤白9 g，全瓜蒌、半夏各12 g。以上药物均购于陕西中医药大学第一附属医院。药物用量参照高学敏主编《中药学》、邓中甲主编《方剂学》以及相关文献[13]。上述中药按常规煎法，每方每服煎取原药液600 ml，后分别浓缩为50 ml的相应浓缩液。对照组则选取达美康，动物灌胃时以150 mg达美康粉末，溶于50 ml纯水中，制成3 mg/ml的达美康混悬液备用。

2 主要实验试剂、仪器

2.1 实验试剂：链脲佐菌素(Streptozoto-cin,STZ )溶液(S8050)、柠檬酸钠缓冲液(C1032)，戊二醛溶液(P1126)、罗丹明123(R8030)购于北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)；812环氧树脂包埋套装(GP18010)、醋酸双氧铀(GS02624)、柠檬酸铅染液(GZ02616)购于北京中镜科仪技术有限公司；四氧化锇(徕卡，GP18456)ATP Elisa试剂盒由上海茁彩生物科技有限公司生产；无水乙醇、二甲苯生产于成都科龙化工试剂厂；PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9062)。

2.2 实验仪器：酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司生产，Multlskan Mk3)由陕西中医药大学实验室提供；超薄切片机(LabX，Reichert-Jung)；透射电子显微镜(日本日立，H-600IV)；流式细胞仪(美国碧迪公司，FACSCalibur)；离心机(中佳，KDC-40)。

3 实验动物 8周龄SPF级雄性SD大鼠90只，体重(200±20)g，均购于西安交通大学动物试验中心，动物质量合格证号：SCXK(陕)2017-003。

4 实验方法

4.1 造模、分组方法：新购动物于湿度40%～60%，温度22oC～26oC环境下适应性饲养1周后，逐一称取体重，平均(213.21±23.51)g，并随机选取10只为空白组，剩余80只为模型组。模型组大鼠以高脂高糖饲料喂养4周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ溶液50 mg/kg，选取连续两次血糖监测值均≥16.7 mmol/L的模型大鼠(两次检测时间间隔3 d)，继续饲养4周形成DCM模型[14-15]。然后将成模大鼠随机分为：模型组、达美康组、葛根组、葛芪组、葛参组、葛蒌组、葛芪参蒌组各8只。空白组选取未做造模处理大鼠8只。

4.2 给药方法:各组大鼠均以灌胃给药。给药剂量参照参照施新猷主编《现代医学实验动物学》进行换算，公式：(成人每日用药量/60 kg)×6.25。则各组分别以其浓缩液给药量为：达美康组16.7 mg/(kg·d)；葛根组1.04 g/(kg·d)；葛芪组2.6 g/(kg·d)；葛参组2.6 g/(kg·d)；葛蒌组4.48 g/(kg·d)；葛芪参蒌组7.6 g/(kg·d)；模型组、空白组大鼠则以生理盐水6.5 g/(kg·d)进行灌胃。每组在给药期间均以普通饲料喂养，持续9周。

5 指标检测

5.1 心肌线粒体超微结构检测：各组大鼠经药物治疗后，取大鼠心肌组织，依次经过固定、脱水、渗透、包埋、加热聚合、切片、染色后，通过投射电镜观察各组大鼠心肌线粒体结构，并进行比较。

5.2 心肌线粒体跨膜电位检测：将收集好的心肌细胞用PBS缓冲液清洗2次，后使用Rhodaminel 23染液进行染色，染色后再使用PBS缓冲液清洗2次，而后以250 μl PBS重悬细胞并缓慢加入-20oC乙醇750 ml，使用流式细胞仪对其跨膜电位进行检测并进行比较。

5.3 心肌细胞ATP浓度检测：各组大鼠经药物治疗后，将大鼠心肌组织进行匀浆，取上清液以免疫酶联法检测各组大鼠心肌细胞ATP浓度进行比较。

6 统计学方法 实验数据采用SPSS 22.0统计学软件分析，数据分析结果以均数±标准差表示，其中计量资料采用单因素方差分析中的LSD法进行统计处理，组间数据对比采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义；线粒体超微结构采用描述性分析。

结 果

1 各组大鼠心肌线粒体超微结构比较 空白组心肌肌原纤维无损伤，细胞核均匀分布于心肌组织中，线粒体结构表达清晰，无肿胀，嵴结构完整，线粒体膜无损伤；模型组，部分肌原纤维溶解，心肌细胞核聚集，线粒体肿胀明显，嵴有断裂、溶解，部分线粒体膜损伤；经过药物干预治疗后，达美康组线粒体损伤减轻，嵴结构清晰，但仍有部分线粒体肿胀，嵴断裂或溶解，线粒体膜损伤，肌原纤维受损；各中药治疗组之间，葛参组、葛芪参蒌组线粒体损伤程度均低于葛根组、葛芪组、葛蒌组三组，其线粒体结构完整，嵴结构清晰，但仍存在部分线粒体肿胀，嵴断裂或溶解。其中以葛芪参蒌组线粒体损伤最低，且低于达美康组，表现为肌原纤维无明显损伤，线粒体无明显肿胀，嵴无明显的断裂或溶解，线粒体膜损伤减轻，心肌细胞核分布均匀(图1)。

图1 各组大鼠心肌线粒体超微结构

2 各组大鼠心肌线粒体跨膜电位比较 模型组大鼠线粒体跨膜电位荧光强度较空白组降低，波峰左移明显；各治疗组线粒体跨膜电位荧光强度与空白组、模型组比较，则可通过叠加图直观的展现，各治疗组波峰均在模型组、空白组之间；各治疗组中，葛芪参蒌组、葛参组、葛根组三组波峰位于达美康组右侧；这三组中又以葛芪参蒌组波峰最接近空白组(图2)。

图2 各组大鼠心肌线粒体跨膜电位叠加图

3 各组大鼠心肌细胞ATP浓度比较 见表1。各组较空白组，ATP浓度值显著降低(P<0.05)；药物干预后，达美康组、各中药治疗组ATP浓度值明显高于模型组(P<0.05)；同时，中药治疗组中除葛芪参蒌组ATP浓度值明显高于达美康组外(P<0.05)，其余各中药治疗组ATP浓度值与达美康组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而各中药治疗组之间比较，葛芪参蒌组ATP浓度值明显高于其余各中药治疗组(P<0.05)，其余各中药治疗组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠心肌细胞ATP浓度比较(nmol/L)

讨 论

中医认为，DCM与“消渴”“心悸”“胸痹”“胸痛”“真心痛”等症相对应，而这些疾病之间又存在一定关联，同时与脾胃关系密切。如《素问·奇病论》：“脾瘅……此人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”。明确指出了，脾胃与消渴发病关系密切。而张仲景、巢元方在其著作中均有“消渴”与“心痛”“胸痹”相关联的描述，如《诸病源候论》中提到：“消渴重，心中痛”。因此“消渴”兼见“胸痹”“胸痛”“心痛”时可以脾胃为主进行治疗，如《素问·经脉别论》中指出：“食气入胃，浊气归心，淫精于脉”即心血充沛、心脉充盈来源于脾胃化生气血，脾胃虚弱“四肢不用，五脏不安”，影响及心，终致“脾病不能为胃行其津液……气日以衰，脉道不利……”症见胸痹、心痛等，则为此类疾病的治疗奠定了理论依据，张景岳则于《类经·疾病》中提到：“上虚而痛者，心脾受伤也，非补中不可”的治疗方法，可见中医认为DCM的关键病机是以脾气虚弱为主而导致的津液代谢失常，气血生化无源，气无力推动血行而成痰浊、瘀血阻滞心脉最终发生胸痹、心痛等症。

同时近年来有研究发现心肌细胞能量代谢异常及心肌细胞数量减少可能是导致糖尿病心肌病心脏功能受损的重要病理生理机制[16]。而线粒体功能障碍在糖尿病发生过程中起着关键作用[17]，高血糖引起线粒体功能损伤后导致线粒体能量代谢异常、ROS产生增加、启动线粒体依赖性的凋亡途径、线粒体的分裂和融合紊乱以及心磷脂含量及结构改变，又会引起糖尿病心肌病变。而究其功能的正常实现，主要依赖于线粒体膜流动性及线粒体膜通透性转换的正常，二者在维持线粒体功能中起着关键作用[18]，可见线粒体功能正常与否与其结构完整息息相关。通过前文述及脾胃、线粒体、DCM之间存在一定关联，因此我们以脾胃为中心，选定归属脾胃经药物葛根，结合中医对DCM病机认识，以益气、化瘀、祛痰三法与葛根组成相关配伍，对模型大鼠心肌线粒体质量变化进行了观察。

研究发现，DCM大鼠心肌线粒体存在一定程度的损伤，同时伴随有膜电位降低，通过药物干预后，损伤心肌线粒体都得到了不同程度的修复，膜电位有了不同程度的增加，心肌ATP浓度有所提升，而ATP水平的升高表明线粒体功能增强，能量供应充足，动能增加，细胞、组织运动能力加强[19]，可见以脾胃为中心的葛根相关配伍，能够通过线粒体质量的正向调控，从而达到一定的治疗目的。但单味葛根及以单一治法确立的葛根配伍对受损线粒体结构的修复、膜电位的正向调控均不及以益气、化瘀、祛痰三法结合为组方原则的葛根配伍，可见益气、化瘀、祛痰三法结合能够更好的调节脾胃功能，使气足、血行、邪祛，进而产生一定的协同增效作用。

综上，线粒体结构的损伤在DCM的发生发展及治疗中可能扮演着重要的角色，以脾胃为中心的葛根相关配伍可能是通过改善线粒体损伤结构，提高其功能，调控线粒体质量正向发展，进而达到治疗DCM的作用，这与有关研究的结果不谋而合[20]。同时研究发现，以化瘀为原则进行的配伍，对线粒体质量正向调控优于以益气、祛痰为原则进行的配伍，并且益气、化瘀、祛痰三法结合具有一定的协同增效作用，可见，临床治疗中，可通过以脾胃为中心，益气、化瘀、祛痰三法结合的组方原则进行药物配伍治疗，同时加重化瘀药物使用比例，可能会取得更好的效果，这也可能是中医治疗DCM的科学内涵。但是就线粒体质量控制而言，本次研究仅仅涉及到线粒体结构、功能方面的研究，至于线粒体动态平衡(如线粒体自噬，线粒体分裂、融合)方面没有涉及，那么以脾胃为中心，益气、化瘀、祛痰三法结合的组方原则进行配伍的方剂，是否也能有效调控线粒体动态平衡，仍有待于进一步研究。