预针刺对AD样大鼠学习记忆能力及TLR4/NF⁃κB信号通路的影响

何川 黄重生 陈虹茹 余超超 郑清 王月燊 陈芸芸 孔立红

1湖北中医药大学针灸骨伤学院（武汉430061）；2针灸治未病湖北省协同创新中心（武汉430061）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种与衰老相关的进行性神经退行性疾病，以记忆丧失和多种认知功能障碍为特征，是发病率最高的痴呆类型［1］。AD 的发病机制复杂，淀粉样斑块沉积和神经元纤维缠结是AD 主要的病理学特征，神经炎性反应是AD 发生的重要因素［2-3］。小胶质细胞（microglia，MG）是中枢神经系统主要的免疫细胞，研究发现多种刺激因素可通过TLR4/NF⁃κB信号通路激活MG，释放炎症因子，加重神经炎症反应，最终导致认知功能的恶化［4-5］。

AD 起病隐匿，尚无有效逆转病理进程的治疗手段，因此采取有效措施早期干预或许能阻止或延缓AD 病理进程。针灸在防治神经退行性疾病中发挥着重要作用［6］。衰老会导致神经炎症反应增强，因此在机体衰老过程中进行针灸同步干预是否能通过TLR4/NF⁃κB 信号通路减轻神经炎症反应，从而缓解认知功能损伤，目前国内外相关文献报告较少。本实验通过建立AD 样大鼠模型（亚急性衰老模型），使用预针刺干预，检测大鼠海马区TLR4/NF⁃κB 信号通路相关分子表达情况，以阐明预针刺早期防治AD 样神经炎症的可能机制，为针灸早期防治AD 提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组清洁级3 个月龄SD 雄性大鼠，体质量360～390 g，由湖北省实验动物研究中心提供（许可证号：SCXK（鄂）2015⁃0018）。适应性喂养1 周后用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、治疗组，每组12 只。实验过程中严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》中有关规定。

1.2 主要仪器和主要试剂针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司），HANS⁃100 A 电针仪（南京济生医疗科技有限公司），Morris 水迷宫（成都泰盟），石蜡切片机（广州三元科技有限公司），电泳仪（北京市六一仪器厂，型号：DYY⁃6C），激光共聚焦显微镜（德国Leica，型号：TCS SP8）；酶标仪（芬兰（Labsystems Multiskan MS）公司产品型号：352 型）；兔抗TLR4、NF⁃κB P65 抗体、Iba⁃1 一抗、山羊抗兔IgG H&L（Cy3®）预吸附二抗（英国Ab⁃cam）；IL⁃1β ELISA 试剂盒（货号：RA20020）、IL⁃6 ELISA 试剂盒（货号：RA20607）、TNF⁃α ELISA 试剂盒（货号：RA20035），均为Bioswamp 公司。

1.3 造模方法采用D⁃半乳糖腹腔注射制备AD样大鼠模型。大鼠称重后，模型组与治疗组腹腔注射D⁃半乳糖［120 mg/（kg·d）］，连续8 周。在实验的过程中通过对大鼠状态的观察，发现与正常组比较，模型组大鼠均出现毛发脱落增多，毛发枯黄粗糙，食量减少，体质量减轻，自由活动积极性显著下降，在摄食及精神方面表现出了一定的衰老症状，与前期文献报道一致［7-8］。

1.4 治疗方法治疗组大鼠于每日造模完成后予电针“百会”、“足三里”治疗，取穴依据中国针灸学会实验针灸学分会指定的《常用实验动物穴位定位图谱》。选择0.25 mm×15 mm 一次性不锈钢针灸针。于“百会”穴处向前平刺3～5 mm，“足三里”直刺约5 mm，接上HANS⁃100 A 型电针治疗仪。一对导线分别接“百会”和“足三里”，左右侧“足三里”交替使用。选用连续波，频率50 Hz，电流1 mA，以穴位局部颤动为佳，留针20 min，每日1 次，共治疗8 周。正常组和模型组同时段抓取固定20 min。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 体质量监测每周测量体质量。

1.5.2 Morris 水迷宫实验定位航行实验：实验前将大鼠放入水池自由游泳2 min，以适应水迷宫环境；平台位于第4 象限中间，距离水面1 cm，将大鼠面向池壁分别从四个象限放入水中各一次，记录其在120 s 内找到隐藏在水面以下平台的时间，记录为逃避潜伏期，若120 s 内未找到平台者则将其引至平台停留10 s，记录逃避潜伏期为120 s，连续5 d。空间探索实验：第6 天撤除平台进行空间探索实验，将大鼠从任选的非平台象限入水点面向池壁放入水中，记录120 s 内跨越原平台位置的次数。水迷宫实验结束后处死大鼠，进行下述实验。

1.5.3 Western blot加入蛋白裂解液提取各组大鼠海马总蛋白；使用BCA 法测定各组蛋白浓度，根据蛋白浓度进行SDS⁃PAGE 电泳及转膜，加入封闭液室温封闭1 h；加入一抗4 ℃过夜；加入二抗；化学发光检测，滴加ECL 混合溶液，曝光、显影、定影、扫描，AlphaEaseFC 软件处理系统分析目标带吸光度值。以目标带的吸光度值与β⁃Actin 条带吸光度值之比为TLR4、NF⁃κB P65 蛋白的相对表达量。

1.5.4 酶联免疫吸附测ELISA 法检测大鼠海马组织IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α含量：取大鼠海马组织匀浆上清液，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.5 免疫荧光标记大鼠灌注固定后，迅速断头取脑放入4%多聚甲醛中固定48 h。随后进行脱水、透明、浸蜡、组织包埋、石蜡切片机切片，常规脱蜡抗原修复后，PBS 冲洗5 min×3 次，滴加Iba⁃1一抗（1∶100），4 ℃过夜，PBS 冲洗5 min×3 次；滴加山羊抗兔IgG H&L（Cy3®）预吸附二抗，37 ℃暗盒孵育1 h，PBST 冲洗5 min×3 次；滴加DAPI 避光常温孵育10 min，PBST 冲洗5 min×3 次，用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片，在激光共聚焦显微镜下采集图片并统计阳性细胞数。

1.6 统计学方法采用统计软件GraphPad Prism 6 进行数据分析，所有数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，继以独立样本t检验比较两组之间差异，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量比较造模结束后，模型组大鼠体质量低于正常组，且差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，电针干预使大鼠体质量增加，且差异有统计学意义（P< 0.01，图1）。说明电针能改善衰老引起的体质量下降。

图1 体质量比较Fig.1 Comparison of weight

2.2 Morris 水迷宫测试结果比较水迷宫实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠平均逃避潜伏期延长，平台穿越次数和在目标象限探索时间减少，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，电针干预能缩短大鼠平均逃避潜伏期，增加平台穿越次数和在目标象限探索时间，差异有统计学意义（P< 0.01），说明电针能改善AD 样大鼠空间学习记忆能力，见图2-4。

2.3 各组大鼠海马CA1 区活化小胶质细胞数目的比较正常组大鼠海马CA1 区Iba⁃1 阳性细胞胞体小，密度低，增大活化的细胞较少。模型组活化的小胶质细胞数目较正常组明显增多，差异有统计学意义（P< 0.01）；治疗组活化的小胶质细胞数目较模型组减少，差异有统计学意义（P< 0.05，图5A、B）。

图2 各组大鼠5 d 逃避潜伏期比较Fig.2 Comparison of 5⁃day escape latency of rats in each group

图3 各组大鼠目标象限探索时间的比较Fig.3 Comparison of the target quadrant exploration time of rats in each group

图4 各组大鼠跨越原平台次数的比较Fig.4 Comparison of the times of crossing the original platform of rats in each group

图5 海马CA1 区活化的小胶质细胞（免疫荧光染色，红色荧光为Iba⁃1 标记的活化小胶质细胞）Fig.5 Activated microglia in CA1 area of hippocampus（The activated microglia labeled with Iba⁃1 were stained by immunofluorescence）

2.4 海马区TLR4、NF⁃κB P65蛋白表达的比较Western blot 检测结果显示，模型组TLR4 和NF⁃κB P65 蛋白表达水平显著高于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）；治疗组蛋白表达水平显著低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01，图6）。

2.5 海马区TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 含量的比较模型组大鼠海马区炎症因子TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 含量明显高于正常组（P< 0.01）；治疗组大鼠海马区炎症因子较模型组明显减少，差异有统计学意义（P<0.01，图7）。

3 讨论

图6 海马区TLR4、NF⁃κB P65 蛋白表达水平的变化Fig.6 Changes of TLR4 and NF⁃κB p65 protein expression in hippocampus

神经炎性反应在AD 的病理进程中具有重要作用。研究表明，衰老会导致神经炎症反应的持续增强，进而引起神经细胞和组织生理功能的退化及结构完整性的破坏，从而增加神经退行性疾病的易感性［9］。因此于机体衰老的过程中进行早期干预控制炎症反应，或许对早期防治AD 具有重要意义。

学习记忆功能的丧失是AD 患者最主要的临床症状之一。研究发现，电针能改善AD 模型大鼠认知功能障碍［10］。本实验也发现，电针干预能缩短AD 样大鼠水迷宫实验平均逃避潜伏期，增加平台穿越次数和在目标象限探索时间。由此可见，预针刺能提升AD 样大鼠空间学习记忆能力。

小胶质细胞（MG）是中枢神经系统的固有巨噬细胞。生理状态下，MG 处于静止状态，起免疫监视作用。各种有害因素刺激下会迅速导致MG激活，转变成阿米巴样巨噬细胞状态吞噬清除有害物质［11-12］。然而炎症刺激因素持续存在会导致MG 的长期慢性激活，形成炎症反应恶性循环，最终导致神经细胞坏死和认知功能障碍［13-14］。本实验结果表明，模型组大鼠海马CA1 区MG 胞体增大，密度增加，活化的细胞较多，预针刺能抑制MG的活化，从而抑制神经炎症。

TLR4 是Toll 样受体家族中重要的模式识别受体，主要分布在小胶质细胞，能够与刺激因素特异性结合，从而激活NF⁃κB，并促进其核转移，导致促炎细胞因子基因表达上调［15-16］。小胶质细胞的长期慢性激活以及TLR4/NF⁃κB 信号通路已被证实与AD 的神经炎性反应及认知功能障碍密切相关。抑制TLR4/NF⁃κB 信号通路能够改善AD 大鼠模型神经炎性反应及学习认知功能［17］。植物提取物如姜黄素、芹黄素等也能通过调节TLR4/NF⁃κB 信号通路从而减轻炎性反应［18-19］。本实验研究发现，模型组大鼠海马组织中TLR4/NF⁃κB 信号通路相关蛋白及炎症因子表达上调，预针刺能抑制TLR4/NF⁃κB 信号通路相关蛋白。由此可推断，预针刺能改善AD 样大鼠神经炎症反应，其机制可能与抑制TLR4/NF⁃κB 信号通路有关。

中医学强调“未病先防”，故本研究采用预针刺作为干预手段，以早期控制神经炎症反应为切入点，体现了中医“治未病”的独到之处。“百会”、“足三里”为临床治疗AD 的常用穴，现代研究表明，两穴合用能改善AD 大鼠学习记忆认知功能，减轻神经炎性反应［20］。

综上所述，预针刺能改善AD 样大鼠空间学习记忆能力，减轻神经炎症反应，其机制可能与抑制TLR4/NF⁃κB 信号通路有关。但是，本研究不能排除预针刺通过其他信号通路如NLRP3 炎症小体信号通路发挥作用，也没对星形胶质细胞进行观察，因此其具体作用机制当进一步研究。