姜黄素联合多西他赛对宫颈癌hela细胞的增殖抑制及凋亡作用的研究

钟琳琳 邹平安 娄 俊 王 超 胡爱民

宫颈癌原发于宫颈上皮组织，是妇科常见恶性肿瘤之一，其发病率在妇科肿瘤中仅次于乳腺癌，且近年来发病率呈不断上升及年轻化趋势。多西他赛联合顺铂肾毒性及胃肠道反应大，因此亟需寻找替代化疗药物。本研究拟以宫颈癌hela细胞为研究对象，通过MTT试验及流式细胞仪检测细胞凋亡情况，研究姜黄素是否能够增强多西他赛对宫颈癌细胞增殖抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌hela细胞株购自北京协和医科大学生物细胞库;F12型培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶冻干粉(含EDTA)购自美国Sigma公司;表阿霉素购自齐鲁药业公司,溶于灭菌去离子水中制备成10 mg/ml的母液,培养基稀释成工作浓度,4 ℃储存;DMSO及MTT购自美国Sigma公司,溶于二甲基亚砜(DMSO)中制备成50 mg/ml的母液，培养基稀释成工作浓度(用培养基稀释后工作液DMSO浓度<1%)，-20 ℃储存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 hela细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的F12型培养液中，其中青霉素、链霉素各100 U/ml，于37 ℃、5%CO2的饱和湿度孵育箱中培养。细胞传代后第3～5天，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞增殖抑制实验 调整细胞数为1×104/ml接种于无菌96孔培养板，每孔100 μl，继续培养12 h，待细胞贴壁后，姜黄素单独作用组分别给予含姜黄素浓度分别为20 μmol/ml,40 μmol/ml，60 μmol/ml，80 μmol/ml,100 μmol/ml的培养液200 μl；多西他赛单独作用组分别给予含多西他赛浓度分别为多西他赛浓度分别为1 μg/ml,5 μg/ml，10 μg/ml,15 μg/ml，20 μg/ml的培养液200 μl。同时设立DMSO的阴性对照组、F12培养基空白对照组。每组每个浓度下设5个复孔，培养24 h后，每孔加入20 μl的MTT(5 mg/ml)，孵育4 h后，弃上清，加入DMSO，终止反应。微振荡5 min后，于酶标仪波长490 nm处测吸光度(A)。以上各组实验重复3次。抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。用细胞存活率对剂量对数作图并按作图法求出IC50值。选取2种药物最小浓度以及两种药物最接近IC50且小于IC50的浓度做联合实验。(即选用20 μmol/ml姜黄素+1 μg/ml多西他赛以及40 μmol/ml姜黄素浓度+5 μg/ml多西他赛做联合实验)。采用Q值判断姜黄素和多西他赛联合用药的性质。Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)。公式中Ea代表单药A的抑制率，Eb代表单药B的抑制率，Ea+b代表两药联用的抑制率。Q值>1.15为两药协同作用，0.85≤Q≤1.15为相加作用，Q<0.85为拮抗作用。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 选取2种药物最小浓度以及两种药物最接近IC50且小于IC50的浓度做联合实验(即选用20 μmol/ml姜黄素+1 μg/ml多西他赛以及40 μmol/ml姜黄素浓度+5 μg/ml多西他赛做联合实验)，以等量的DMs0作对照，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒厂家说明对细胞进行染色，检测凋亡率。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MTT试验检测药物对细胞的抑制作用

在两种药物单独作用下，hela细胞经不同浓度姜黄素、多西他赛处理24 h后，细胞生长程度受到不同程度的抑制，且抑制程度依赖于药物剂量的增加，其IC50分别为42.83 μmol/ml和6.18 μg/ml(图1、2)。各实验组与对照组抑制率比较差异有显著性(P<0.05)。在联合组中，hela细胞经联合药物处理24 h后，细胞抑制率明显增高；20 μmol/ml姜黄素+1 μg/ml多西他赛的联合用药组Q值=1.22,为协同作用；40 μmol/ml姜黄素浓度+5 μg/ml多西他赛的联合用药组Q值=0.93，为相加作用(表1)。

图1 MTT检测姜黄素对Hela细胞增殖抑制率

图2 MTT检测多西他赛对hela细胞增殖抑制率

表1 MTT检测联合药物组对hela细胞增殖抑制率

2.2 流式细胞仪分析法检测细胞凋亡结果

从图3中可以看出，hela细胞分别经20 μmol/ml姜黄素，1 μg/ml多西他赛及两者联合处理24 h，细胞凋亡率分别为(16.5±1.2)%、(14±0.9)%及(23.5±1.3)%，联合组与单药组细胞凋亡率间有统计学差异(P<0.01)。hela细胞分别经40 μmol/ml姜黄素，5 μg/ml多西他赛及两者联合处理24 h，细胞凋亡率分别为(20.1±1.1)%，(22.2±1.8)%及(43.2±3.3)%，联合组与单药组细胞凋亡率间有统计学差异(P<0.01)。姜黄素能增强多西他赛对人宫颈癌细胞(hela)的凋亡效应。

注：A为阴性对照组；B为20 μmol/ml姜黄素组；C为1 μg/ml多西他赛；D为20 μmol/ml姜黄素+1 μg/ml多西他赛组；E为40 μmol/ml姜黄素；F为5 μg/ml多西他赛组；G为40 μmol/ml姜黄素+5 μg/ml多西他赛组。

3 讨论

多西他赛作为1种细胞生长抑制剂，与β微管蛋白亚蛋白能特异性结合，将细胞骨架蛋白的解聚阻断，在有丝分裂期使微管不能形成纺锤体和纺锤体丝，从而使肿瘤细胞的分裂和繁殖阻止[1]。多西他赛联合顺铂已成为宫颈癌的一线化疗方案[2]。但顺铂肾毒性及胃肠道反应大，因此亟需寻找替代化疗药物。

姜黄素是1种从姜黄科根茎类提取的多酚类类物质[3]，具有广泛的抗肿瘤作用。近年国内外研究表明，姜黄素对口腔癌、胃癌、食管癌等多种癌细胞表现出较强的抑制作用[4-6]。王静等的试验证明姜黄素能通过降解Hsp90蛋白的机制，来抑制宫颈癌hela细胞的增殖[7]。姜黄素联合顺铂 不但抑制宫颈癌 Hela细胞的增殖并诱导细胞凋亡，而且增加其敏感性，其机制可能与抑制p53基因表达有关[8]。多西他赛为传统的宫颈癌化疗药物，疗效确切，有研究证明，多西他赛单独应用时可对宫颈癌 Hela细胞产生抑制作用，与野生型p53基因联用时，其药物抑制作用增强[9]。

本实验结果证实hela细胞经不同浓度姜黄素、多西他赛处理24 h后，细胞生长程度受到不同程度的抑制，且抑制程度依赖于药物剂量的增加。联合用药后，细胞抑制率明显增高，Q值分别为1.22(20 μmol/ml姜黄素+1 μg/ml多西他赛)和0.93(40 μmol/ml姜黄素浓度+5 μg/ml浅蓝菌素)，证明姜黄素能增强多西他赛对人宫颈癌细胞(hela)的抑制效应。经过流式细胞仪分析法，证实联合组与单药组细胞凋亡率之间有统计学差异(P<0.01)。姜黄素能增强多西他赛对人宫颈癌细胞(hela)的及凋亡效应。

本实验只证实姜黄素能增强多西他赛对hela细胞抑制及凋亡作用，但其机制是否与抑制p53基因表达及活性有关，仍需进一步研究。