牛磺酸诱导宫颈癌细胞凋亡的作用及可能机制
2020-10-19梁笑倾万福生
梁笑倾 万福生
宫颈癌(cervical cancer)是女性除子宫内膜癌、卵巢癌之外的常见恶性肿瘤。探讨宫颈癌的靶向治疗方案[1-2]，寻找新的治疗标志物，有重要意义[3]。近年研究表明[4-6]，牛磺酸(Taurine,Tau)能促进肝癌、肺癌及乳腺癌细胞凋亡，但Tau对宫颈癌细胞凋亡研究较少。研究发现MST1-Hippo信号通路[7-8]在细胞凋亡及多种肿瘤发生发展中起重要作用，人哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)是Hippo通路的核心成员之一，以此通路为靶点探讨肿瘤治疗已成为研究热点。本文研究牛磺酸对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响，探讨宫颈癌细胞凋亡的可能分子机制及MST1-Hippo通路在宫颈癌发生发展中的作用，为Tau应用临床提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系和质粒p-EGFP-MST1过表达
人宫颈癌HeLa细胞系购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人野生型MST1的过表达质粒p-EGFP-MST1及空载体p-EGFP-N1由本实验室许传铭合成、鉴定并赠送。
1.2 人宫颈癌细胞增殖的检测
将人宫颈癌HeLa细胞放置于含有青霉素(浓度为100 U/ml)、链霉素(浓度为100 U/ml)及10% FBS(TransGen Biotech,Beijing,China)的DEME完全培养液中，于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对数生长期细胞增殖情况。实验分组如下：空白组，Tau 20 mmol/l组，Tau 40 mmol/l 组，Tau 80 mmol/l 组，Tau 160 mmol/l 组，Tau 320 mmol/l组及DDP 5 μg/ml处理组。
调整细胞密度，接种于96孔板，每孔200 μl单细胞悬液(约含1×103～1×104个细胞)，并用无菌PBS液填充周边孔。细胞培养箱中继续培养24 h、48 h或72 h，加入四甲基偶氮唑盐 (购于Beyotime,Haimen,China)溶液20 μl/孔，继续培养4 h后终止培养，测定每孔的吸光度(波长490 nm)，且连续测量3～5次，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=1-细胞存活率=(1-实验组吸光度A490 nm值/对照组吸光度A490 nm值)×100%；每孔设3个复孔。
1.3 细胞凋亡的检测
通过流式细胞术，Annexin-V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡。将经药物处理48 h后的人宫颈癌HeLa细胞(收集约1-5×105细胞)，加入Binding Buffer液500 μl悬浮，然后加Annexin V-FITC (MultiSciences,Hangzhou,China)液5 μl，混匀后再加PI(Propidium Iodide) 液5 μl，混匀后在室温避光反应5～15 min。在流式细胞仪上(美国Becton Dickinson，Facscallbar型流式细胞仪)检测细胞凋亡率。顺铂(Cisplatin，DDP)作为阳性对照。
1.4 宫颈癌细胞中凋亡相关蛋白水平的检测
提取药物处理48 h后的人宫颈癌细胞总蛋白，加入十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)并煮沸5 min，上样，每孔加样量为40 μg，再进行SDS-PAGE电泳。湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，并将此膜与一抗MST1单抗(Cat.#14946，Cell Signaling Technology)、Bcl-2单抗(12789-1-AP,Proteintech公司)、Bax多抗(50599-2-lg，Proteintech公司)和β-actin多抗(AF7018，Affinity公司)等抗体(1∶1200或1∶1500稀释)反应。4 ℃过夜，将膜与辣根过氧化物酶连接的二抗(ZDR-5307，北京中杉金桥公司)(1∶2000)反应1.5 h。最后，暗室内进行ECL免疫检测。应用Image-Pro Plus6.0凝胶图像分析软件对蛋白条带进行灰度值扫描，以β-actin条带为内参进行半定量分析。
1.5 转染
将PolyJetTM体外DNA转染试剂介导空载体质粒pEGFP-N1(Clontech,Mountain View,USA) 及pEGFP-N1-MST1重组质粒(Cat.#SL100688;SignaGen,Rockville,USA)转染到人宫颈癌HeLa细胞中。先将待转染的细胞于六孔板中培养至密度状态为60%～70%左右；然后弃旧培养基，每孔加入新鲜完全培养基约900 μl，培养30～60 min后；再接着在每孔加入转染液50 μl，轻轻混匀后37 ℃、5%CO2培养箱内培养5 h，然后换成10% FBS的DMEM培养基再培养24 h或48 h后，用荧光显微镜观察转染效率并拍照。
转染液的制备：先将1 μg质粒溶于50 μl 无血清DMEM培养基，轻轻反复吹打3～4次，此为①液；然后将3 μl PolyJetTM试剂溶于50 μl 无血清DMEM培养基，轻轻反复吹打3～4次，此为②液；最后将②液迅速加入①液中，并迅速反复吹打3～4次，室温静置15 min，此即为转染液。
1.6 统计学处理
2 结果
2.1 Tau对宫颈癌细胞株HeLa细胞增殖的影响
MTT法检测HeLa细胞的增殖活性。结果显示见表1，Tau对HeLa细胞增殖有显著抑制作用，随着药物浓度的增加，细胞生长抑制率逐渐增高，呈现剂量依赖性和时间依赖性。Tau作用于HeLa细胞24 h,48 h,72 h的IC50值为198.76 mmol/l,93.24 mmol/l,64.55 mmol/l。
2.2 Tau对HeLa细胞凋亡的作用
采用Annexin-V-FITC/PI双染色法检测不同浓度Tau(0～320 mmol/l)处理HeLa细胞48 h的凋亡率。实验结果如图1所示，Tau浓度较低(20 mmol/l、40 mmol/l、80 mmol/l )组与空白组无显著性差异，而Tau 160 mmol/l 组的早晚期凋亡率为21.95%，Tau 320 mmol/l 组的总凋亡率为30%，均与空白组的差异有统计学意义(P<0.01)。提示高浓度的Tau能促进HeLa细胞凋亡。
2.3 Tau对HeLa细胞中MST1、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的作用
用Western Blot检测不同浓度Tau作用 HeLa细胞48 h后细胞中凋亡标志蛋白MST1、Bax、Bcl-2表达水平。结果如图2所示，与对照组比较，Bcl-2蛋白表达随着Tau浓度逐渐升高而降低(P<0.01)，MST1蛋白和Bax蛋白表达随着Tau浓度逐渐升高而升高(P<0.01)，差异均有统计学意义。Tau浓度为20 mM，40 mM，80 mM，160 mM组的Bax/Bcl-2比值分别为0.288±0.015，0.571±0.018，1.944±0.052，2.368±0.055，与对照组(0.196±0.012)比较均有显著性升高(P<0.05)。
表1 牛磺酸对HeLa细胞的增殖抑制作用
图1 Tau对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用
2.4 MST1过表达在Tau诱导 HeLa细胞凋亡中的作用
Annexin-V-FITC/PI双染法检测MST1过表达之后HeLa细胞的凋亡率。结果如图3所示，Tau 160 mmol/l组，p-EGFP-MST1组,p-EGFP-MST1+ Tau 160 mmol/l 组的凋亡率分别为20.52%，33.19%，64.1%，与Control和p-EGFP-NC相比均有统计学意义(P<0.01)。p-EGFP-MST1+ Tau 160 mmol/l 组与p-EGFP-MST1相比有统计学意义(P<0.01)。说明MST1过表达与Tau会产生协同作用，对HeLa细胞凋亡有促进的作用。
3 讨论
牛磺酸(Taurine,Tau)是由食物中摄取的人体的必需含硫-氨基酸，具有内源性抗炎、抗氧化、降血糖、调节血脂、增强机体免疫调节等多种作能[6,9-10]，主要用于心血管疾病、肝胆及眼科疾病的防治。近年发现Tau不仅对心肌缺血(缺氧)/再灌注损伤有很好的保护作用[10-12]，而且还具有较好的抗肿瘤作用[13-14]，其通过诱导肿瘤细胞凋亡、调控凋亡通路分子、加强化疗药物的疗效并降低化疗药物毒副作用、提高机体抗氧化能力，达到抗肿瘤效果。早期研究[14]发现，予甲氨蝶呤化疗后的移植性S180肉瘤荷瘤小鼠，饮用蒸馏水中含1%Tau的小鼠的存活时间高于单饮用蒸馏水组小鼠17天。观察组抑瘤率高达43%，并且骨髓抑制反应轻，中性粒细胞高于对照组；观察组抗凋亡蛋白Bcl-2明显降低，促凋亡蛋白Bax明显升高，细胞凋亡明显增加。研究发现[5-8]Tau可诱导或调控乳腺癌及肝癌等肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，且Tau对p53-/-肿瘤细胞抑制率高于p53+/+肿瘤细胞的增殖抑制率[15]，其主要机制是增加p53上调凋亡调控因子(PUMA)水平，最终促进癌细胞凋亡。本实验研究Tau对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响及MST1过表达对HeLa细胞凋亡相关蛋白的影响，结果发现Tau浓度为20～320 mmol/l之间，Tau对宫颈癌细胞HeLa的增殖呈显著性抑制作用，抑制作用与剂量和时间成正比。
图2 HeLa细胞中MST1、Bax、Bcl-2蛋白表达水平
图3 MST1过表达在牛磺酸诱导HeLa细胞凋亡中的作用
研究表明[5,16]MST-Hippo通路在结直肠癌发生发展中有重要作用，MST已经成为肿瘤靶向治疗的研究热点。研究发现Tau能诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡[17]，但少见有关MST在宫颈癌防治中的研究报道。Tau能否通过调控MST1，Bax及Bcl-2蛋白表达来诱导宫颈癌细胞凋亡尚未完全弄清。本文实验结果(见图2)显示，Tau能显著提高宫颈癌HeLa细胞中凋亡标志蛋白MST1、Bax 蛋白水平(P<0.01)，降低Bcl-2蛋白表达水平(P<0.01) ；并且过表达MST1对Tau诱导HeLa细胞凋亡有较好的促进作用，即MST1蛋白与Tau具有协同作用，共同促进HeLa细胞凋亡。研究表明MST1蛋白在牛磺酸抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和诱导凋亡中发挥了关键性作用，能否成为治疗宫颈癌的新靶点值得深入探讨，为Tau和化疗药物同时运用与宫颈癌患者提供有利实验依据。
