P-糖蛋白对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤的抑制作用△

冯绮婷 梁瑜钦 黄雄飞 张跃红

老年性黄斑变性(senile macular degeneration，SMD)是一种累及黄斑的神经退行性疾病，是工业化国家50岁以上人群不可逆性盲的首要原因[1-2]。随着中国人口老龄化加剧，SMD的发病率逐年增高。然而，到目前为止，人们对SMD的发病机制仍未完全明确，也缺乏有效的干预手段。

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞功能紊乱、退化和死亡是造成视网膜受损和SMD发病的病理学基础。RPE细胞是血-视网膜外屏障的重要组成部分，承担着视网膜代谢物质转运、光感受器外节段降解以及保护视网膜免受光损害等重要作用[3]。由于RPE细胞需要高氧耗才能维持正常生理功能，因此，RPE细胞能产生大量的氧自由基。随着年龄增长，人体内抗氧化防御系统功能下降，体内氧自由基不能被及时清除，容易引起氧化应激反应。研究证明,RPE细胞的氧化损伤参与了SMD的发病过程[4-6]。在氧化应激源攻击后，RPE细胞出现线粒体功能障碍、变性甚至死亡，继而导致黄斑区RPE细胞萎缩及功能改变，造成难以挽回的视力损害[7-8]。

细胞在氧化应激应答时，一方面，通过启动抗氧化防御系统纠正失衡的氧化还原状态[9]；另一方面，利用自我保护机制从而减缓自身损害[10]。目前，关于后者的研究较少。有文献指出，P-糖蛋白是细胞自我保护机制中一个重要分子[11-12]。P-糖蛋白由多重耐药基因编码的膜转运蛋白组成，在生理条件下表达于正常的排泄器官和组织屏障，协助组织排出代谢废物。在血-脑屏障中，已证明P-糖蛋白的高表达是氧化应激损伤中神经自我保护的一种表现[13]。本研究我们使用人RPE细胞株D407细胞模拟血-视网膜外屏障，利用H2O2作为氧化应激源刺激细胞建立SMD模型，观察细胞中P-糖蛋白的功能性表达变化以及对细胞氧化损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco BRL公司)，H2O2、罗丹明123和ATP检测试剂盒(上海Sigma-Aldrich公司)，P-糖蛋白抗体(上海Abcam公司)，GAPDH抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，P-糖蛋白抑制剂Tariquidar(上海Selleckchem公司)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(美国Bender MedSystems公司)，Accuri C6流式细胞仪(美国BD Bioscience公司)。

1.2 细胞培养及分组取人RPE细胞株D407细胞(购买于中山大学动物实验中心)，放入体积分数5% CO2培养箱中用含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基于37 ℃传代培养。先将细胞按H2O2浓度梯度进行处理(0 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1)，使用免疫印迹实验和罗丹明123蓄积实验确定H2O2对P-糖蛋白表达的最佳诱导浓度。将细胞随机分为3组：对照组、H2O2模型组、H2O2+ P-糖蛋白抑制剂组(H2O2+ Tariquidar)用于后续实验。

1.3 免疫印迹实验收集各组细胞样本，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液后，离心提取总蛋白。测定蛋白浓度，用SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜并用脱脂牛奶封闭1 h后分别用抗P-糖蛋白抗体和GAPDH抗体于4 ℃孵育过夜。洗膜并加入辣根过氧化物酶标记二抗，在室温下孵育1 h。采用Bio-Rad公司的胶片凝胶成像。

1.4 罗丹明123蓄积实验通过测量细胞内P-糖蛋白荧光性底物罗丹明123蓄积量检测P-糖蛋白功能活性。当P-糖蛋白功能增强时，细胞内罗丹明123外排增加，导致细胞内蓄积量减少，表现为细胞内荧光强度降低；反之，当P-糖蛋白功能受抑制，则表现为细胞内荧光强度增加。在利用H2O2刺激D407细胞前，预先使用1 μmol·L-1P-糖蛋白抑制剂Tariquidar处理细胞1 h。使用胰蛋白酶收集细胞，经PBS清洗后置入500 nmol·L-1罗丹明123在常温下避光孵育1 h。用BD Accuri C6流式细胞仪检测并分析细胞内罗丹明123荧光强度，通过平均荧光强度衡量罗丹明123蓄积量。

1.5 ATP水平检测使用ATP测定法检测细胞内ATP水平。将400 μmol·L-1H2O2与生长在96孔板的D407细胞单独培养或与1 μmol·L-1P-糖蛋白抑制剂Tariquidar共同培养24 h 后，用50 μL ATP释放试剂渗透细胞膜并与含有荧光素-荧光素酶的混合试剂在室温下共同反应10 min。通过ATP荧光检测仪测定发光量。

1.6 Annexin V-FITC凋亡检测实验通过Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。将细胞以每孔106个细胞的密度接种在6孔板中。然后收集细胞用PBS重悬并离心5 min。将细胞重悬于含有5 μL Annexin V-FITC的195 μL的结合缓冲液中，并在室温下避光孵育10 min。离心5 min后，弃上清液并用190 μL结合缓冲液和10 μL碘化丙啶(PI)在黑暗中对细胞染色。然后立即用流式细胞仪分析细胞。绿色荧光表示Annexin V-FITC 阳性，而红色荧光表示PI阳性。左下象限中的细胞(Annexin V-FITC阴性/PI阴性)表示正常活细胞；细胞在左上象限(Annexin V-FITC阴性/PI阳性)属于允许的检测误差；在右上象限(Annexin V-FITC阳性/PI阳性)代表晚期凋亡和坏死细胞；在右下象限(Annexin V-FITC阳性/PI阴性)代表早期凋亡细胞。

1.7 统计学处理采用SPSS 16.0软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析或组间两两比较进行检验；计数资料采用χ2检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 H2O2对人RPE细胞P-糖蛋白表达的促进作用免疫印迹实验结果显示，随着H2O2浓度的增加，P-糖蛋白相对表达量呈剂量依赖性增加并在400 μmol·L-1时达到最高值，0 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2处理细胞后P-糖蛋白相对表达量分别为0.39±0.02、0.77±0.05、1.38±0.20、1.70±0.14、2.71±0.19和1.45±0.12。与0 μmol·L-1H2O2相比，200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2处理细胞后P-糖蛋白的表达均明显增加，差异均有统计学意义(均为P<0.01)(见图1)。

图1 免疫印迹实验检测不同浓度H2O2处理后RPE细胞P-糖蛋白表达情况 以GAPDH为内参，当H2O2浓度为200 μmol·L-1时，P-糖蛋白表达开始增加，并于400 μmol·L-1达到峰值

2.2 H2O2增加人RPE细胞P-糖蛋白功能活性检测细胞内罗丹明123荧光强度可以了解P-糖蛋白的功能活性。结果显示，与0 μmol·L-1H2O2相比，200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2处理细胞后细胞内荧光强度均下降，并在400 μmol·L-1浓度时出现最低值，差异均有统计学意义(均为P<0.01)(见图2)。这提示200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和800 μmol·L-1H2O2能有效增加P-糖蛋白的转运活性。H2O2在浓度400 μmol·L-1时对P-糖蛋白表达和功能均有最明显的诱导作用，该浓度为最佳处理浓度，后续实验均以400 μmol·L-1H2O2作为模型诱导浓度。

图2 罗丹明123蓄积实验检测不同浓度H2O2处理细胞后细胞内罗丹明123荧光强度 与0 μmol·L-1 H2O2相比，**P<0.01，***P<0.001

2.3 P-糖蛋白对RPE细胞内ATP水平的影响P-糖蛋白非竞争性抑制剂Tariquidar抑制效果见图3。结果显示，H2O2+ P-糖蛋白抑制剂组中细胞内罗丹明123水平较H2O2模型组增加，差异有统计学意义(P<0.01)，Tariquidar能有效抑制P-糖蛋白功能。

图3 罗丹明123蓄积实验中检测荧光强度验证P-糖蛋白抑制剂Tariquidar的抑制效果 **P<0.01

细胞内ATP水平检测结果见图4，H2O2模型组ATP水平较对照组显著下降，差异有统计学意义(P<0.001)；而H2O2+ P-糖蛋白抑制剂组ATP水平则较H2O2模型组更低，差异亦有统计学意义(P<0.05)，提示抑制P-糖蛋白功能可进一步加剧氧化应激所导致的ATP水平下降。

图4 荧光素/荧光素酶ATP检测实验检测各组D407细胞内ATP水平 ***P<0.001；*P<0.05

2.4 P-糖蛋白对RPE细胞凋亡的影响细胞凋亡情况见图5，与对照组相比，H2O2模型组细胞凋亡率显著增加，而H2O2+ P-糖蛋白抑制剂组细胞凋亡率则较H2O2模型组增加，提示抑制P-糖蛋白功能可加重氧化应激下的细胞凋亡。

图5 流式细胞仪检测各组D407细胞凋亡情况

3 讨论

目前，探讨SMD病程中RPE细胞氧化损伤以及功能失调是研究SMD发病机制的重要切入点[14-16]。研究发现，在氧化应激情况下组织屏障中P-糖蛋白的高表达可能是细胞自我保护的重要机制[17-18]。本实验在不同浓度H2O2诱导下检测人RPE细胞中P-糖蛋白的表达和功能活性以确定最佳诱导浓度，并在P-糖蛋白功能受抑制的情况下检测细胞氧化损伤情况(以细胞内ATP水平和细胞凋亡率为观察指标)，证实在氧化应激下RPE细胞中P-糖蛋白的高表达能有效减缓细胞的氧化损伤。

P-糖蛋白是腺苷三磷酸结合盒转运蛋白家族中的一员。在生理条件下，P-糖蛋白表达于排泄器官和组织屏障，除了转运药物、毒素等外源性物质外，P-糖蛋白也负责一些内源性物质的排出，如淀粉样蛋白、神经酰胺等，参与维持组织细胞的生理功能[19]。然而，在某些病理情况下，如氧化应激时，P-糖蛋白的表达和功能可出现上调，这在血-脑屏障[13]和肾近曲小管细胞[17]中均已证实。最近，我们在人RPE细胞株D407细胞中已发现H2O2可以诱导线粒体P-糖蛋白高表达[20]。相似地，本实验中也观察到H2O2诱导的氧化应激上调了人RPE细胞中P-糖蛋白的表达和功能。实际上，氧化应激和P-糖蛋白的调控关系一直是学者们研究的热点，同时也存在较大争议。一方面，有报道提出与我们实验结果相似的结论，即氧化应激促进P-糖蛋白表达上调及功能增强[17]；而另一方面，也有学者发现短时间的氧化应激可减弱P-糖蛋白的表达及转运功能[21]。目前，这一大争议仍未能阐述清楚，我们认为这些差异可能与实验中氧化应激的诱导条件(包括处理因素、处理时间、处理强度等)以及不同的细胞类型有关。

关于P-糖蛋白在氧化应激时对受损细胞的保护作用，Thévenod等[17]研究发现在肾近曲小管细胞中，氧化应激诱导的P-糖蛋白表达以及功能上调能抑制金属镉离子诱导的细胞凋亡。与此同时，Wang等[13]发现在氧化应激下，血-脑屏障和血-脊髓屏障中P-糖蛋白的高表达和外排功能增强均与神经细胞自我保护机制相关。这提示在病理情况下屏障组织中高表达的P-糖蛋白可能起着排泄代谢毒物的保护性作用。然而，该保护性作用在血-视网膜屏障中仍未研究清楚。本研究中，我们观察到P-糖蛋白抑制剂Tariquidar能显著抑制P-糖蛋白转运活性，并进一步加重氧化应激诱导的ATP水平下降和细胞凋亡，这说明P-糖蛋白功能性表达的增强能有效减缓细胞线粒体损伤并增强细胞对凋亡的抵抗，从而保护细胞。但这其中的具体机制仍不明确，需要进一步研究。有文献曾指出这可能与死亡受体介导的caspase 3依赖的凋亡通路受阻有关，通过抑制caspase 3的激活能有效地阻断瀑布式级联的程序性死亡过程[22]。也有报道认为，P-糖蛋白高表达可抑制caspase 8的激活，但并不能影响死亡信号通路[23]。尽管现在众多假说仍未得以证实，但是这些研究仍然提示我们P-糖蛋白对细胞氧化损伤确实起着一定的抑制和抵抗作用。

综上所述，在H2O2诱导的氧化应激SMD模型中，P-糖蛋白的表达增加和功能增强在一定程度上抑制了RPE细胞凋亡，这对于进一步了解SMD的发生发展来说是一个新的切入点，给SMD视网膜损伤防治提供了新的研究方向。